论文部分内容阅读
目的:通过建立大鼠原代肝细胞模型,从细胞水平上研究何首乌炮制前后及主要成分的肝细胞毒性和对UCB在肝细胞内摄取及外排的影响。初步推测何首乌引起黄疸的原因、物质基础,为何首乌的合理应用以及药物性黄疸的预防、治疗提供新的理论依据和科学支撑,具有重要的临床意义。方法:1、何首乌炮制前后及主要成分的肝细胞毒性(1)构建大鼠原代肝细胞模型,显微镜下察看细胞形态,利用台盼蓝检测肝细胞存活率及产率。(2)分别用11个产地的RPME与PPME及12个主要成分进行给药,用CCK-8法测定RPME、PPME及12个成分的肝细胞毒性,推测何首乌肝细胞毒性的产地差异性和主要肝毒性成分。2、何首乌炮制前后及其主要成分对UCB摄取的影响(1)建立UCB在大鼠原代肝细胞样本中的检测及样品处理方法。(2)对大鼠原代肝细胞摄取UCB孵育时间进行考察。(3)考察11个产地RPME、PPME及12个成分对大鼠原代肝细胞摄取UCB的影响,推测何首乌导致黄疸是否与UCB摄取相关以及影响UCB摄取的主要成分。考察何首乌及Em、Ph、Ga、Ca、Ep、Rh六个成分抑制大鼠原代肝细胞摄取UCB的类型。3、何首乌炮制前后及其主要成分对UCB外排的影响(1)建立大鼠原代肝细胞“三明治”培养模型。(2)考察11个产地RPME、PPME及12个成分对大鼠原代肝细胞外排UCB的影响,推测何首乌导致黄疸是否与UCB外排相关以及影响UCB外排的主要成分。结果:1、何首乌炮制前后及主要成分的肝细胞毒性(1)随着浓度的增加,各产地RPME、PPME对大鼠原代肝细胞的毒性越来越强。12h时,RPME中山西的IC50值最小,为1122±84.02μg/mL,PPME中山东的IC50值最小,为4789±379.1μg/mL;24h时,RPME中湖北的IC50值最小,为260.77±19.18μg/mL,PPME中山西的IC50值最小,为937.5±52.08μg/mL;48h时,RPME中河南的IC50值最小,为380.07±10.86μg/mL,PPME中湖北的IC50值最小,为1498±40.78μg/mL。与贵州产地相比,12h时,RPME、PPME各有四个产地有统计学差异;24h时,RPME有四个、PPME有一个产地有统计学差异;48h时,RPME与PPME的所有产地均无统计学差异。(2)随着浓度的增加,各成分对大鼠原代肝细胞的毒性越来越强。随着时间的延长,Em、Em-G、Rh、Ep的IC50值越来越小,在12h、24h、48h三个时间点的IC50值分别为:Em:625±14.51、257.57±12.17、180.63±15.68μM;Em-G:785.4±91.09、657.77±7.51、462.3±43.3μM;Rh:810.1±52.6、765.43±103.31、405.07±15.52μM;Ep:422.07±26.1、380.33±30.42、341.3±15.68μM。三个时间点,均为Ph的IC50值最小,分别为418.43±34.26、148.3±13.23μM、176.93±6.56μM。与Em相比,12h、24h、48h分别有六个、七个、九个成分有统计学差异。2、何首乌炮制前后及主要成分对UCB摄取的影响(1)建立的原代肝细胞样本中UCB的检测方法专属性好,其定量限与检测限分别为0.01μM与0.005μM。UCB在0.01~2μM浓度范围内线性关系良好。(R2=0.9998)。日内和日间精密度RSD均<5.5%,准确度94.2%~101.1%。在反复冻融以及冻存过程中稳定性良好。UCB在大鼠原代肝细胞中加样回收率>99.91%,基本无基质效应。(2)大鼠原代肝细胞摄取UCB在10~40 min急速增长,40 min后达到平稳的趋势。(3)吉非贝齐能明显抑制UCB摄取,各产地RPME随着浓度的增加对UCB摄取均有抑制作用,其中陕西产地的IC50值最小,云南产地的IC50值最大,分别为52.54±3.33、388.67±97.23μg/mL。与贵州产地的IC50值相比较,其他产地均未有统计学差异。(4)各产地PPME随着浓度的增加对UCB摄取均有抑制作用,其中湖北产地的IC50值最小,陕西产地的IC50值最大,分别为204.2±13.72、440.67±39.64μg/mL。与贵州产地的IC50值相比较,广西、安徽、四川、云南、山西、陕西六个产地具有统计学差异,且何首乌抑制UCB摄取类型为反竞争性抑制。(5)各成分随着浓度的增加对UCB摄取均有抑制作用。其中Em的IC50值最小,为8.12±0.51μM,除Em以外,Ph、Ga、Ca、Ep、Rh的IC50值均在20μM左右,分别为:15.6±0.84μM、17.03±0.8μM、29.4±2.14μM、23.25±2.06μM、23.97±2.02μM。除TSG与5-HMF未计算出IC50值以外,其他成分的IC50值均大于50μM。与Em的IC50值进行比较,其结果均具有统计学差异。此外,Em、Ph、Ga、Ca、Ep、Rh的抑制类型均为混合型抑制。3、何首乌炮制前后及主要成分对UCB外排的影响(1)构建的大鼠原代肝细胞“三明治”培养模型活性良好,满足UCB外排实验要求。(2)在有Ca2+与无Ca2+的缓冲液中孵育后,大鼠原代肝细胞外排UCB在10 min逐渐趋向平稳。(3)含钙状态下,河南与广西(均200μg/mL)、湖南与陕西(均16μg/mL)产地RPME对UCB蓄积表现为抑制作用;其他产地RPME或浓度对UCB的蓄积为诱导作用或无明显影响。无钙状态下,河南与广西(均200μg/mL)、河南(50μg/mL)、四川(16μg/mL)产地RPME对UCB蓄积表现为抑制作用,其他产地RPME或浓度对UCB的蓄积为诱导作用或无明显影响。另外,除湖南(200μg/mL)、贵州与广西(均50μg/mL)、河南(16μg/mL)产地RPME对UCB的BEI有抑制作用,其他产地RPME或浓度对UCB的BEI为诱导作用或无明显影响。而对于UCB的CL,湖南(16、200μg/mL)、陕西(16、50、200μg/mL)、广西(50、200μg/mL)产地RPME为抑制作用,其他产地RPME或浓度对UCB的CL为诱导作用或无明显影响。(4)有钙状态下时,湖北(25、100、500μg/mL)、山东与陕西(均500μg/mL)以及湖南(25、100μg/mL)产地PPME对UCB蓄积有抑制作用,其他产地PPME对UCB蓄积呈诱导作用或无明显影响。无钙状态下,所有产地PPME在考察浓度下表现为诱导作用或无明显影响。此外,湖南与河南(均25、100、500μg/mL)和安徽与山东(均25、100μg/mL)、广西与四川及云南(均500μg/mL)产地PPME对UCB的BEI均为抑制作用,其他产地PPME或浓度表现为诱导作用或无明显影响。而对于UCB的CL,湖南与河南(均25、100、500μg/mL)、安徽与山东(均25、100μg/mL)、陕西与云南(均500μg/mL)、湖北(16μg/mL)产地PPME表现为抑制作用,其他产地PPME或浓度为诱导作用或无明显影响。(5)含钙状态下,Em、A-Em、Ph、Ca、Ep五个成分在所有考察浓度和Rh(2.5、20、100μM)、Ga(2.5、20μM)以及Ch、Ph-G(均100μM)、Em-G(20μM)对UCB蓄积表现为抑制作用,其他成分或浓度则表现为诱导作用或无明显影响。无钙状态下,Ch、Ph两个成分在所有考察浓度与Em-G(20、100μM)以及Ep、Ga、5-HMF(均20μM)、Ph-G(2.5μM)对UCB蓄积表现为抑制作用,其他成分或浓度则表现为诱导作用或无明显影响。Em与Ga(均20、100μM)、Ca(2.5、100μM)、Ep和Ph(均100μM)对UCB的BEI为抑制作用,其他成分或浓度为诱导作用或无明显影响。而对于UCB的CL,Ph、Ep、Ga(均2.5、20、100μM)和A-Em(2.5、100μM)、Em与Ca(均2.5、100μM)、Em-G(2.5、20μM)、Rh(100μM)、Ch(2.5μM)均为抑制作用,其他成分或浓度则表现为诱导作用或无明显影响。结论:(1)本实验构建的二步原位胶原酶灌流法可以获得较多大鼠原代肝细胞,且存活率高。(2)本实验构建的大鼠原代肝细胞贴壁培养及“三明治”培养模型活性良好,可较好的用于肝细胞毒性、UCB摄取及UCB外排实验研究。(3)本实验建立的原代肝细胞样本中UCB的检测方法灵敏度高,专属性好,可用于UCB在相关样本中浓度的检测。(4)所有产地的RPME与PPME均可抑制UCB摄取,类型为反竞争抑制,部分产地的RPME与PPME可抑制UCB的外排。因此临床上何首乌致黄疸的主要原因可能是抑制UCB摄取而导致,且不同产地的抑制作用有所不同。此外,炮制确有减毒作用,但大剂量给药时,所有产地的PPME仍有肝细胞毒性。所以临床上使用何首乌与制何首乌时需注重其用量,还应关注产地差异性。Em、Ph、Ga、Ca、Ep的肝细胞毒性明显,且对UCB的摄取与外排均有明显的抑制作用。因此Em、Ph、Ga、Ca、Ep可能是何首乌临床上致黄疸的主要成分,其具体机制还需进一步研究。