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第一部分 肝纤维化小鼠差减文库的构建 探寻差异表达基因的实验方法不断进展，为筛选与血吸虫病相关基因提供了研究条件。SSH法为Diatchenko等1996年首次报道，在DD基础上建立起来的一种新的以抑制性PCR反应为基础cDNA的杂交方法。SSH灵敏度高，在一次实验中可分离出上百个差别表达的基因，对于高、低丰度的差异表达mRNA均可有效富集，且mRNA用量少，仅需1-2μg。在小鼠血吸虫发病过程中，宿主对血吸虫的免疫应答中脾脏起重要作用，特别是T淋巴细胞，而致肝纤维化的靶细胞是HSC，因此我们选择脾脏和分离HSC作为血吸虫病发病研究的靶细胞可以保证研究的特异性，避免了用肝脏作为研究对象有成虫、虫卵等干扰因素存在，从而减少工作的盲目性。 1．材料与方法 本课题首先建立感染日本血吸虫尾蚴的小鼠血吸虫病肝纤维化动物模型，研究取材血吸虫尾蚴感染小鼠后的急性期(6周)，正常组与模型组的脾脏进行两两比较；感染后慢性期(16周，即肝纤维化期)正常组与模型组的HSC进行两两比较，将正常组定义为Driver，将模型组定义为Tester。然后分别抽提RNA、经分离纯化为mRNA、经逆转录，酶切、经两轮杂交与PCR扩增后T/A克隆构建文库，并对克隆进行PCR扩增和正反向的Dot blot筛选，选取部分阳性克隆测序，与GenBank同源比较，再用Virtual Northern Blot验证差异表达的基因。 2．结果 建立日本血吸虫尾蚴感染致肝纤维化的小鼠模型，并成功分离小鼠HSC。用SSH法建立日本血吸虫感染小鼠差异表达基因的cDNA文库，筛选与日本血吸虫病相关的基因，为该疾病的发病机理与治疗提供新的依据。通过BLAST搜寻， 浙江大学博士学位论文在76个测序结果中发现在脾脏消减文库中，含有许多与免疫相关的ESTS，在慢性阶段的HSC消减文库中发现了生长因子结合蛋白的基因、与分化相关的基因等，提示它们与慢性肝纤维化阶段HSC的活化增殖有关，关于它们的作用还值得进一步研究。文库的构建为进一步筛选、鉴定在血吸虫病肝纤维化起作用的基因奠定了基础。 3．结论 门）成功分离出血吸虫病肝纤维化小鼠 HSC，通过 SSH法建立了脾脏和 HSC两个差减文库，核酸序列分析和 GenBank同源比对结果表明其中部分 ESTs为与血吸虫病肝纤维化相关的基因，其它部分ESTs的研究提示其与纤维化相关，还发现了一些未知序列，可能为与血吸虫病肝纤维化相关的新基因。 （2）通过差减效率分析、文库筛选、核酸测序与序列分析、Virtual NorthernBI。t的验证，证实了SSH法在血吸虫病肝纤维化基因筛选研究中是一种灵敏、有效的方法。 （3）下一步的研究：对于与纤维化相关的基因和未知基因在血吸虫病肝纤维化中的作用值得进一步研究；并对这些基因在血吸虫病肝纤维化发生、发展中的机理从蛋白质组水平进行探索。 6 浙江大学博士学位论文第二部分 血吸虫病肝纤维化病人 chitinase 3－like protein（YKL－40）的表达 肝纤维化是一切慢性肝病的共同病理学基础，是发展到肝硬变的必经阶段，并与肝癌的发生有一定关系。肝纤维化的发展是一个动态过程，在进入肝硬化前尚有逆转可能。其早期诊断对肝硬化的防治有重要意义，因此人们十分重视肝纤维化的诊断工作，肝穿刺活检被认为是诊断肝纤维化的金标准，但因为它是创伤性检查，有一定的风险，也不易为患者接受；此外，由于所取组织很小，因而诊断上也有一定局限性，而且不易作动态观察。因此，寻找判断肝纤维化敏感和准确的血清学指标成为改进诊断的主要努力方向。 我们在研究感染日本血吸虫尾锄造模的小鼠基因差异表达的HSC消减文库中发现有一差异表达的基因一chitinase 3Ake protein，在人其相应的基因表达产物为YKL－40。为了明确YKL－40在血吸虫病肝纤维化病人血清中的表达及其临床意义，在血吸虫病肝纤维化病人中检测其血清蛋白水平，并与血清HA水平进行了比较。 l材料与方法 门）研究对象563例血吸虫病患者进行腹部B超检查，根据国际标准按肝实质回声分级分为0、I、11、Ill级，对其中60例1、皿级肝纤维化病人进行 YKL－40和透明质酸（hyaluronic acid，HA）的检测。并与正常名进行比较。 （2）方法：ELISA检测血清YKL－40（QUIDEL公司，美国），同时用放免法进行血清HA检测。 （3）统计学分析：以肝实质回声为标准对血清 YKL－40和 HA诊断血吸虫病肝纤维化价值进行比较分析。用 SPSSll．0进行统计学分析。 2．结果：0、I、Ill病人的HA分别为82．97土35．74 u g／。l，216．12士77．86u g／ml，212．61士80．92 u g／ml；YKL－40 分别为 48．97土 10．37卜 g／ml， 7 浙江大学博士学位论文92．27士18．47 u g／ml，172．08．62土35．90ug／ml。发现血吸虫病肝纤维化病人血清YK