论文部分内容阅读
【目的】
1.建立球型马拉色菌（Mg）、糠秕马拉色菌（Mf）感染THP-1细胞模型。
2.筛选与验证Mg、Mf感染THP-1细胞后关键的炎症小体相关因子。
【方法】
1.马拉色菌及细胞培养：用改良Leeming-Notman固体琼脂糖培养基（MLNA）培养糠秕马拉色菌标准株（CBS1878）、球型马拉色菌标准株（CBS9597），用PBS调整菌悬液浓度至1×109个孢子/ml。THP-1细胞用100nM佛波酯（PMA）RPMI-1640完全培养基诱导分化为巨噬细胞。
2.感染方法：THP-1细胞用20个感染复数（MOI）糠秕、球型马拉色菌感染或脂多糖处理0h、6h、12h、24h、48h、72h。
3.实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：检测NOD样受体家族（23个）、AIM2、热蛋白（pyrin）、半胱天冬酶-1（Casp-1）、IL-1β、IL-18等28个基因表达水平，筛选差异表达明显炎症因子。
4.WesternBlot（WB）：检测基因差异表达的炎症小体相关因子及5个经典炎症小体（NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、pyrin）蛋白表达。
5.ELISA：检测Casp-1、IL-1β和IL-18水平。
6.统计学分析：采用SPSS22.0软件进行方差分析及t检验。
【结果】
1．Mg感染THP-1细胞后炎症因子筛选与验证
qRT-PCR结果显示：除NLRP5、NLRP11、NLRP13之外，其余炎症因子表达均有不同程度升高；NLRP3、NLRP4、NLRP10、NLRC4、Casp-1、IL-1βmRNA表达具有统计学意义（P<0.05），其中NLRP4、NLRP8、NLRP10、Casp-1、IL-1β在感染后48h上调最明显，而NLRP3、NLRC4在72h达高峰。WB结果表明Casp-1、cleaved-Casp-1、IL-1β、IL-18表达在感染后24h达高峰，NLRP4、NLRP10、AIM2、pyrin表达在48h最明显，而NLRP3、NLRC4表达在72h达峰值（P<0.05）。ELISA发现IL-18、Casp-1、IL-1β水平分别在感染后48h、72h、72h达峰值（P<0.01）。
2．Mf感染THP-1细胞后炎症因子筛选与验证
qRT-PCR结果显示：除NLRP5、NLRP11之外，其余炎症因子均有不同程度增加；NLRP3、NLRP4、NLRP10、AIM2、Casp-1、IL-1β、IL-18mRNA表达具有统计学意义（P<0.05），其中Casp-1表达在感染后12h达高峰，NLRP3、NLRP4、NLRP10、IL-1β、IL-18表达在感染后24h上调最明显，AIM2在72h达高峰。WB结果表明NLRP10、pyrin、cleaved-Casp-1、IL-1β、IL-18表达在24h上调最显著，NLRP3、NLRP4、NLRC4、Casp-1表达在48h表达最明显，而AIM2表达在72h达峰值（P<0.05）。ELISA发现IL-18、Casp-1、IL-1β水平分别在感染后24h、48h、72h达峰值（P<0.01）。
3．Mg、Mf感染THP-1细胞激活炎症因子的比较
qRT-PCR结果显示NLRP3、NLRP10表达在Mg感染后24h明显低于Mf感染，而NLRP3、NLRP4、NLRP8、NLRP10、NLRC4、IL-1β表达在48h~72h明显高于Mf感染。WB结果表明Mg感染后NLRP3、NLRC4、Casp-1、IL-1β表达明显升高，而Mf感染后NLRP4、NLRP10、AIM2、pyrin、IL-18表达显著上调。ELISA发现Mg感染明显上调Casp-1、IL-1β水平，而Mf感染主要引起IL-18水平增加。
【结论】
1.Mg、Mf对THP-1细胞的最佳感染时间均为24h。
2.Mg感染THP-1细胞后主要激活NLRP3、NLRP4、NLRP10、NLRC4，主要引起IL-1β释放；
3.Mf感染THP-1细胞后主要激活NLRP3、NLRP4、NLRP10、AIM2，主要引起IL-18释放。
4.Mf感染THP-1细胞24h内引起的炎症反应更明显，而Mg在48h后引起炎症效应更显著。
1.建立球型马拉色菌（Mg）、糠秕马拉色菌（Mf）感染THP-1细胞模型。
2.筛选与验证Mg、Mf感染THP-1细胞后关键的炎症小体相关因子。
【方法】
1.马拉色菌及细胞培养：用改良Leeming-Notman固体琼脂糖培养基（MLNA）培养糠秕马拉色菌标准株（CBS1878）、球型马拉色菌标准株（CBS9597），用PBS调整菌悬液浓度至1×109个孢子/ml。THP-1细胞用100nM佛波酯（PMA）RPMI-1640完全培养基诱导分化为巨噬细胞。
2.感染方法：THP-1细胞用20个感染复数（MOI）糠秕、球型马拉色菌感染或脂多糖处理0h、6h、12h、24h、48h、72h。
3.实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：检测NOD样受体家族（23个）、AIM2、热蛋白（pyrin）、半胱天冬酶-1（Casp-1）、IL-1β、IL-18等28个基因表达水平，筛选差异表达明显炎症因子。
4.WesternBlot（WB）：检测基因差异表达的炎症小体相关因子及5个经典炎症小体（NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、pyrin）蛋白表达。
5.ELISA：检测Casp-1、IL-1β和IL-18水平。
6.统计学分析：采用SPSS22.0软件进行方差分析及t检验。
【结果】
1．Mg感染THP-1细胞后炎症因子筛选与验证
qRT-PCR结果显示：除NLRP5、NLRP11、NLRP13之外，其余炎症因子表达均有不同程度升高；NLRP3、NLRP4、NLRP10、NLRC4、Casp-1、IL-1βmRNA表达具有统计学意义（P<0.05），其中NLRP4、NLRP8、NLRP10、Casp-1、IL-1β在感染后48h上调最明显，而NLRP3、NLRC4在72h达高峰。WB结果表明Casp-1、cleaved-Casp-1、IL-1β、IL-18表达在感染后24h达高峰，NLRP4、NLRP10、AIM2、pyrin表达在48h最明显，而NLRP3、NLRC4表达在72h达峰值（P<0.05）。ELISA发现IL-18、Casp-1、IL-1β水平分别在感染后48h、72h、72h达峰值（P<0.01）。
2．Mf感染THP-1细胞后炎症因子筛选与验证
qRT-PCR结果显示：除NLRP5、NLRP11之外，其余炎症因子均有不同程度增加；NLRP3、NLRP4、NLRP10、AIM2、Casp-1、IL-1β、IL-18mRNA表达具有统计学意义（P<0.05），其中Casp-1表达在感染后12h达高峰，NLRP3、NLRP4、NLRP10、IL-1β、IL-18表达在感染后24h上调最明显，AIM2在72h达高峰。WB结果表明NLRP10、pyrin、cleaved-Casp-1、IL-1β、IL-18表达在24h上调最显著，NLRP3、NLRP4、NLRC4、Casp-1表达在48h表达最明显，而AIM2表达在72h达峰值（P<0.05）。ELISA发现IL-18、Casp-1、IL-1β水平分别在感染后24h、48h、72h达峰值（P<0.01）。
3．Mg、Mf感染THP-1细胞激活炎症因子的比较
qRT-PCR结果显示NLRP3、NLRP10表达在Mg感染后24h明显低于Mf感染，而NLRP3、NLRP4、NLRP8、NLRP10、NLRC4、IL-1β表达在48h~72h明显高于Mf感染。WB结果表明Mg感染后NLRP3、NLRC4、Casp-1、IL-1β表达明显升高，而Mf感染后NLRP4、NLRP10、AIM2、pyrin、IL-18表达显著上调。ELISA发现Mg感染明显上调Casp-1、IL-1β水平，而Mf感染主要引起IL-18水平增加。
【结论】
1.Mg、Mf对THP-1细胞的最佳感染时间均为24h。
2.Mg感染THP-1细胞后主要激活NLRP3、NLRP4、NLRP10、NLRC4，主要引起IL-1β释放；
3.Mf感染THP-1细胞后主要激活NLRP3、NLRP4、NLRP10、AIM2，主要引起IL-18释放。
4.Mf感染THP-1细胞24h内引起的炎症反应更明显，而Mg在48h后引起炎症效应更显著。