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背景和目的宫颈癌的病理发展被认为是一个复杂的发病过程,涉及一系列抑癌基因和致癌基因的失调。近20年来,我国宫颈癌发病率逐年升高,发病年龄也趋于年轻化,现已成为继乳腺癌后我国女性第2大常见恶性肿瘤。宫颈癌中最常见的病理类型是鳞癌,大约占所有病例的75%。尽管手术和放、化疗可以增加宫颈癌的治疗效果,但由于术后复发和耐药性等原因,目前宫颈癌死亡率依然很高。而宫颈癌疫苗主要用于一级预防,且不能覆盖所有人乳头瘤病毒型别。因此,寻找一种新的宫颈癌治疗手段势在必行。近些年来,随着“精准医疗”的提出,人们在宫颈癌的研究方面正致力于寻找新的肿瘤标志物用于早期诊断和靶向治疗。基因治疗一般是针对导致病症的源头即异常基因为目标的一类生物医学诊治措施。它是通过向靶细胞中导入正常的基因或者抑制靶细胞中异常基因的表达,从而达到治疗疾病的效果。目前我国已经上市的4种基因治疗药物中有2种是治疗肿瘤的,包括:重组人p53腺病毒注射液和H101基因工程腺病毒注射液。它们的用法主要是瘤体内注射辅助放疗。新近研究发现,天冬酰胺酶1(ASRGL1)是一个新的候选肿瘤标志物,其在乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和卵巢癌中高表达,在子宫内膜癌中低表达或缺失。但在宫颈癌中,ASRGL1基因的表达和作用情况却没有相关报道。因此,我们运用免疫组化检测ASRGL1蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达情况,运用RT-PCR检测ASRGL1 mRNA在宫颈癌细胞系中的表达情况。接着采用慢病毒介导的ASRGL1-shRNA感染宫颈癌SiHa细胞,使基因沉默,分析基因下调前后SiHa细胞生物学活性变化,鉴定ASRGL1基因的功能,以此评估其是否是宫颈癌的致癌基因,为宫颈癌的基因治疗提供理论基础。实验方法1.采用免疫组化方法检测32例宫颈鳞癌及32例正常宫颈组织中ASRGL1蛋白表达情况,并分析ASRGL1基因与宫颈癌的相关性。2.采用RT-PCR技术检测HeLa和SiHa两株细胞系中ASRGL1 mRNA表达情况,选择其中表达量高的一株进入后续试验。3.构建和鉴定ASRGL1干扰慢病毒表达载体。4.利用ASRGL1干扰慢病毒表达载体构建ASRGL1基因下调的SiHa细胞,通过流式细胞技术检测细胞周期、凋亡,Celigo高通量细胞分析仪记录细胞增殖,检测感染前后SiHa细胞生物学活性。5.利用Western blot检测慢病毒感染SiHa细胞前后ASRGL1蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白A(cyclin A)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)以及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的表达情况。6.采用统计软件SPSS21.0对实验数据进行统计分析,数值采用均数±标准差呈现,其中宫颈鳞癌组与正常宫颈组的免疫组化分析比较采用卡方检验,慢病毒感染组与对照组差异用t检验进行比较。以P<0.05认为有统计学差异。结果1.免疫组化检测宫颈鳞癌组织中ASRGL1蛋白表达高于正常宫颈组织(P< 0.01)。2.ASRGL1 mRNA在两株细胞中均表达,但人宫颈鳞癌细胞系SiHa中的表达量高于宫颈腺癌HeLa细胞系。3.阳性克隆的PCR鉴定结果显示ASRGL1 shRNA慢病毒质粒连接构建正确。荧光显微镜观察细胞感染效率达80%以上,Western blot及RT-PCR均显示有明显敲减效应,证实成功构建ASRGL1基因慢病毒表达载体。4.利用构建成功的ASRGL1-shRNA慢病毒载体感染SiHa细胞,发现细胞的生物学活性受到抑制。5.慢病毒介导ASRGL1基因下调后,使得CDK2、Cyclin A、Bcl-2表达下降,Bax表达升高。结论1.ASRGL1在宫颈鳞癌组织中的表达高于正常宫颈组织。2.慢病毒介导的ASRGL1-shRNA可以靶向敲减宫颈鳞癌SiHa细胞系中内源ASRGL1表达。3.慢病毒敲减ASRGL1基因后能明显促进SiHa细胞凋亡,抑制其增殖,阻滞细胞于S期,进一步证明ASRGL1是宫颈癌的一个候选癌基因。