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【研究背景】Cathelicidin抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的阳离子肽。Cathelicidin抗菌肽目前仅一种,在小鼠为CRAMP,在人为LL-37。Cathelicidin主要由组织细胞（如上皮细胞）和免疫细胞（如中性粒细胞等）表达。Cathelicidin抗菌肽通过正负静电吸引作用结合并破坏带负电的细菌胞壁或膜结构从而发挥抗菌功能。因此Cathelicidin还具有抵御有包膜病毒如呼吸道合胞病毒、流感病毒的功能。然而,Cathelicidin抗菌肽对于非包膜病毒的作用及机制研究甚少。B3柯萨奇病毒（Coxsackievirus B3,CVB3）是引起病毒性心肌炎（Viral Myocarditis,VMC）的非包膜小RNA病毒。我们实验室先期研究发现,抗菌肽cathelicidin能在体内外显著抑制非包膜病毒CVB3在心肌细胞的复制,显著减轻CVB3诱导的急性心肌炎。为阐明cathelicidin抗非包膜病毒的机制,我们在体外原代心肌细胞证实外源加入cathelicidin具有剂量依赖的抗病毒作用。然而,随后在CVB3感染机体的初始组织-肠道上皮细胞HCT116和CVB3研究常用宫颈癌上皮细胞系Hela中的试验,却意外发现外源加入抗菌肽cathelicidin可剂量依赖地显著促进CVB3在上皮细胞的复制。CVB3是肠道病毒,感染人体时首先感染肠道上皮细胞,随后经大网膜入血后再后续感染胰腺和心脏诱导心肌炎和胰腺炎,因此CVB3在肠道上皮细胞的复制是整个CVB3感染致病的首要过程,对后续多脏器的CVB3感染复制和炎症疾病有显著的影响。而抗菌肽cathelicidin又是上皮细胞等分泌的抗感染固有免疫效应分子。则我们认为cathelicidin显著促进CVB3在肠道上皮细胞的复制是一个重要的科学问题。需要深入研究和机制探讨。本课题聚焦cathelicidin抗菌肽对于非包膜病毒CVB3的作用及其分子机制,特别专注于我们发现的cathelicidin抑制心肌细胞内CVB3复制然而促进肠道上皮细胞内CVB3病毒复制的反常规现象,拟首先通过外源加入cathelicidin抗菌肽和CRISPR/Cas9敲除细胞内源性cathelicidin明确cathelicidin促进肠上皮细胞CVB3复制的现象。进一步,将对病毒感染细胞和复制的多个步骤及相关细胞自噬、凋亡等行为进行研究,试图阐明cathelicidin抗菌肽促进肠道上皮细胞CVB3复制的分子机制。本研究系首次发现和研究抗菌肽促进病毒复制的现象和机制,有助于揭示抗菌肽在非包膜病毒感染上皮细胞的作用和机制,从而为阐明CVB3诱导的急性病毒性心肌炎机制提供新的切入点和思路;同时为抗菌肽在抗病毒免疫治疗的应用提供新视点。【目的】明确抗菌肽cathelicidin促进肠道上皮细胞内CVB3复制的现象及分子机制。【研究方法】1.原代心肌细胞的培养:取出生24小时乳鼠心脏,以胶原酶II和透明质酸酶37℃消化23轮,将消化获得细胞通过差速贴壁法获得心肌细胞,以DMEM-10%FBS培养24hr备用。2.肠道上皮细胞的培养:结肠癌上皮细胞HCT116以DMEM-10%FBS 37℃培养。胰蛋白酶消化传代。3.CVB3体外细胞感染试验:以100μl CVB3（MOI=10）感染细胞,37℃1小时,弃液,无菌PBS洗一遍,DMEM-2%FBS维持液维持。4.CVB3复制蛋白水平的检测:蛋白免疫印迹检测CVB3衣壳蛋白VP1:CVB3感染细胞以预冷RIPA裂解,上清蛋白测浓度后煮沸。蛋白样品行SDS-PAGE电泳,条带转至PVDF膜,5%BSA封闭2 h。兔抗VP1抗体4℃孵育过夜;二抗室温孵育1.5 h,ECL化学发光显色,胶片压片,显影定影。5.CVB3复制RNA水平的检测:荧光定量PCR检测CVB3正负链:RNAiso提取细胞总RNA,逆转成cDNA,SYBR Green实时定量PCR。2-??CT方法计算病毒正负链的相对表达。6.CVB3活性颗粒的效价检测:TCID50方法检测病毒效价:细胞培养上清按10-1-10-10稀释,加30μl至Hela细胞,每天观察,半数细胞折光性变差、皱缩、浮起>50时判为病变。按照TCID50=lg（大于50%病变阳性率的稀释度）+（大于50%病变阳性率的百分数-50）/（大于50%病变阳性率的百分数-小于50%病变阳性率的百分数）。将30μl病毒液数值换算为100μl病毒液数值。换算PFU/ml≈TCID50/ml╳0.7。7.CRISPR/CAS9技术敲除细胞内源性cathelicidin:HCT116细胞构建嘌呤霉素抗性的cas9细胞株,筛选阳性克隆,用设计的LV-sgRNA感染cas9稳转细胞株,荧光筛选胞内敲除cathelicidin。8.病毒吸附细胞和穿入细胞的检测:吸附试验:4℃预冷,CVB3（MOI=20）感染细胞,同时加LL37,4℃置1h使病毒结合细胞无法进入胞内。弃上清洗三遍,加DMEM-10%FBS继续培养18h收细胞蛋白。病毒穿入细胞试验:4℃预冷,CVB3（MOI=20）感染细胞,4℃置1h使吸附,弃上清洗三遍,加DMEM-10%FBS,同时加LL37,37℃培养1h,弃上清洗三遍,DMEM-10%FBS 37℃培养18h收细胞蛋白。9.细胞自噬的检测:蛋白免疫印迹检测自噬相关蛋白LC3:CVB3感染细胞0,2,4,6,8h收细胞蛋白。SDS-PAGE,转PVDF膜,5%BSA封闭;兔抗LC3I/II抗体4℃孵育过夜;二抗孵育1.5 h,ECL化学发光显色。免疫荧光检测LC3:CVB3感染细胞6h弃上清,4%多聚甲醛室温固定15分钟,0.25%TRITON?X-100破膜5分钟,10%BSA封闭30分钟,兔抗LC3I/II抗体37℃孵育2小时,二抗37℃ 45分钟。DAPI室温10分钟染胞核,激光共聚焦显微镜下观察。10.流式检测细胞凋亡:重悬CVB3感染细胞,加Annexin V-APC和7-AAD,室温避光孵育15分钟。上机检测。11.蛋白免疫印迹检测ERK信号通路和AKT信号通路相关蛋白:CVB3感染HCT116细胞018hr,收细胞蛋白,SDS-PAGE,转PVDF膜,以ERK,p-ERK,AKT,p-AKT,mTOR,p-mTOR等抗体检测相关蛋白。12.统计方法:数据均以均值±标准差表示;组间比较采用方差分析;分析以GraphPad Prism 5和SPSS 11软件完成,P<0.05存在显著性差异。【结果】1.520μg/mL的LL37和CRAMP抗菌肽对细胞无毒性。2.以CVB3感染（MOI=10）原代心肌细胞,外源加入Cathelicidin抗菌肽可剂量依赖地抑制CVB3在原代心肌细胞的复制。2、Cathelicidin抗菌肽可剂量依赖地显著促进CVB3在肠道上皮细胞HCT116的复制。以GFP-CVB3或CVB3感染（MOI=10）HCT116,同时加入520μg/m L抗菌CRAMP和LL37,以乱序无功能的s LL-37与sCARMP为对照,发现:1)流式检测GFP阳性细胞证实:CRAMP和LL37均可剂量依赖地促进胞内荧光CVB3的增加;2)CVB3感染18小时,western blot检测CVB3衣壳蛋白VP1水平,发现LL37和CRAMP显著上调VP1表达,且具有剂量依赖性;3)感染18小时荧光定量PCR发现2种抗菌肽显著提高CVB3的RNA复制与载量;4)细胞上清TCID50试验发现20μg/m L的LL37和CRAMP可使CVB3在HCT116产生的活性病毒颗粒效价由105pfu显著上升至107 pfu。证实Cathelicidin抗菌肽可剂量依赖地促进CVB3在肠道上皮细胞的复制。3、Cathelicidin抗菌肽显著促进了CVB3在人宫颈癌上皮细胞HeLa、人肺癌上皮细胞A549和人肾上皮细胞HepG-2的复制,提示Cathelicidin抗菌肽促进CVB3在上皮细胞的复制。4、CVB3感染肠道上皮细胞HCT116自4小时起,显著上调了肠上皮细胞内源性Cathelicidin抗菌肽的表达。5、以CRISPR-Cas9基因编辑技术建立稳定敲除cathelicidin的HCT116-Cas9细胞株,再感染CVB3发现:内源性cathelicidin敲除后,CVB3感染18小时的衣壳蛋白VP1表达量显著降低,病毒RNA复制量和载量显著减少,上清活性病毒颗粒效价显著降低。再次证实:Cathelicidin抗菌肽可显著促进CVB3在肠道上皮细胞的复制。6、从病毒细胞感染细胞过程探讨了cathelicidin抗菌肽促进肠道上皮细胞CVB3复制的分子机制,发现:通过4℃条件CVB3孵育细胞1hr同时加抗菌肽（病毒吸附）随后弃上清再培养试验,和4℃条件CVB3孵育细胞1hr后弃上清、再加抗菌肽37℃孵育1hr、再培养试验（病毒穿入细胞）,发现cathelicidin能促进CVB3的吸附细胞和穿入细胞的过程。7、CVB3感染细胞诱导细胞自噬促进病毒复制,但在感染08hr,抗菌肽cathelicidin的加入不影响CVB3诱导的LC3I/LC3II比例上调即自噬发生。8、流式细胞术检测Annexin V+7-AAD-早期凋亡细胞,发现抗菌肽cathelicidin促进CVB3感染细胞发生早期凋亡。9、CVB3感染过程伴随ERK磷酸化增加,抗菌肽cathelicidin的加入在前期增强p-ERK的激活,ERK信号通路抑制剂U0126显著抑制LL37作用下CVB3复制,提示抗菌肽影响ERK通路激活。10、CVB3感染激活AKT信号通路启动病毒RNA的转录翻译。发现:CVB3感染4hr时p-AKT尚未激活无VP1蛋白表达;感染6hr才诱导p-AKT和病毒VP1表达;加入cathelicidin抗菌肽不仅在6hr时显著增强p-AKT激活、上调VP1蛋白水平;在感染4h就已显著上调p-Akt水平、从而提前启动了Akt通路激活介导的病毒RNA转录。提示抗菌肽cathelicidin能提前激活胞内AKT通路,显著促进CVB3的胞内转录复制。【结论】1、抗菌肽cathelicidin在体内外均显著抑制CVB3在原代心肌细胞的复制,但是可显著促进CVB3在肠道上皮细胞的体外复制。2、敲除肠道上皮细胞内源性cathelicidin,可显著降低CVB3的复制。3、抗菌肽cathelicidin促进CVB3在肠道上皮细胞内的复制的分子机制,主要通过促进病毒吸附和穿入细胞、促进肠道上皮细胞的早期凋亡、增强早起ERK磷酸化、提前激活胞内Akt磷酸化、促进CVB3的胞内转录复制来实现。