研究背景:骨质疏松症(OP)是一种系统性的骨骼疾病,其特征是骨量减少、骨组织显微结构退化,骨脆性增高,骨折危险性增加的一种代谢性骨病,多发生于绝经后妇女和老年男性。据流行病学统计,OP的发生率在代谢性骨病中居第二位;随着世界人口老龄化趋势的发展,OP导致的骨折并发症的发生率日益增高。绝经后骨质疏松(PMO)在OP中占有很大的比例。较长时期以来,其治疗主要是采用激素替代疗法(HRT)。虽然HRT在预防和治疗PMO方面呈现出较好的效果,然而,因其副作用及禁忌症导致HRT的临床应用受到限制。据报道,由于浸润性乳腺癌和心血管疾病危险性的增加,美国国立卫生研究院提前三年结束了已经进行了5.2年的HRT在健康绝经妇女更年期综合征的临床试验。因此,寻找安全、有效的防治PMO的药物,及缓解更年期症状,是目前研究的热点。植物雌激素是来源于植物的一类具有类黄酮结构的物质。它们的结构与雌激素相似,能够选择性地与雌激素受体(ER)结合,呈现较弱的雌激素样作用。与雌激素相比,其副作用比较少,尤其是较少引起激素依赖性肿瘤的发生,因而得到广泛的关注。但是植物雌激素的生物活性相对较弱,疗效不稳定,难以有效改善更年期症状。目前研究较多的植物雌激素主要是大豆异黄酮类的染料木素(Gen),大豆苷元和大豆黄素等。1994年,Kasten TP等人研究发现,抑制一氧化氮合酶(NOS)可增加去卵巢大鼠骨质的吸收;对NOS的抑制能够剂量依赖性地抑制成骨细胞(OB)的增殖。研究显示,去卵巢大鼠血清NO含量在骨密度和雌激素水平下降的同时亦明显降低。雌激素水平降低引起NO水平降低,NO水平降低促进骨吸收,导致骨量丢失,骨密度下降,这可能是PMO发生的重要机制之一。研究表明,PMO患者体内难以产生足够的NO以维持正常生理功能,这是NO作为替代药物治疗PMO的合理的生物学基础。研究证实,缓慢释放的小剂量NO能够促进OB增殖及其功能。因此,调控NO释放的药物具有潜在的OP治疗的广阔前景。研究目的:研究文献资料,根据Gen的结构特点,参考具有缓慢释放一氧化氮功能的非甾类抗炎药(NO-NSAIDs)的结构,设计、合成出将Gen与NO供体部分通过化学反应生成酯键相连的一氧化氮供体Gen(NO-G)的前体药物。该结构在体内经过生物转化,酯键断裂,游离出原药Gen和NO供体部分,后者能够缓慢释放出NO,与Gen协同发挥作用,以期对OP,尤其是PMO起到有效的预防和治疗作用。研究方法1. NO-G的结构设计、合成及鉴定分析Gen的结构,参照NO-NSAIDs的结构设计,采用化学合成的方法经酯化反应和硝基化反应得到目标化合物,通过核磁(NMR),红外(IR)和质谱分析(MS)对得到的化合物进行结构确证。2. NO-G高效液相色谱法(HPLC)检测方法的建立及其体外稳定性的实验研究。2.1参考文献关于Gen检测的方法,经多次实验摸索,建立了NO-G的HPLC检测方法;2.2 NO-G的体外稳定性实验研究2.2.1.模拟生理环境下的稳定性实验将NO-G溶解后分别于37℃pH 1.0(模拟胃液环境)和pH 6.8(模拟小肠液环境)条件下震荡,于0,0.5,1,1.5,2,3h取样,行HPLC检测,考察NO-G的稳定性;2.2.2. NO-G在培养细胞上的稳定性研究采用成骨细胞系MC3T3-E1细胞株进行实验,HPLC检测观察NO-G在培养细胞上的稳定性。3. NO-G体外活性研究采用成骨细胞系MC3T3-E1细胞株进行实验研究3.1 NO-G与细胞共孵育释放NO的观察通过Griess Reagent检测培养液中亚硝酸盐的含量间接反应NO的释放情况。以常用的NO供体SNAP为对照,比较二者NO释放的特点。3.2体外活性研究以Gen,SNAP和雌二醇(E2)为对照,观察新化合物对OB增殖,分化和矿化功能的影响。3.2.1 NO-G对MC3T3-E1细胞增殖的影响a.通过MTT法观察NO-G对细胞增殖的浓度和时间依赖关系,比较与其它药物作用的差别。b.流式细胞术分析NO-G对细胞周期的影响。3.2.2 NO-G对MC3T3-E1细胞分化的影响a.采用ALP试剂盒检测观察NO-G对ALP活性的影响,观察其浓度和时间依赖关系;并与其它药物对ALP活性的影响进行比较。b.采用OCN ELISA试剂盒检测NO-G对OCN分泌的影响,观察其浓度和时间依赖关系;并与其它药物对OCN分泌的影响进行比较。3.2.3 NO-G对MC3T3-E1细胞矿化的影响通过茜素红-S染色定量观察药物对矿化结节形成情况的影响。实验结果:1.通过化学合成的方法得到产物NO-G:浅灰色粉末状,熔点125.5~127.5°C,产率约为87.6%。质谱分析其相对分子量为532.04,核磁,红外结果显示其结构与目标化合物一致。2.建立了NO-G的HPLC检测方法;色谱条件为:流动相,乙腈: 0.1%的冰醋酸溶液60:40;流速1ml/min;检测波长:254nm;色谱柱,C18(250×4.6mm, 5μm, Lichrospher);柱温:室温;进样量20μl。3. NO-G在不同pH环境中的稳定性不同。在模拟胃液环境(pH1.0)中不稳定,37℃水浴振荡0.5h即可检测到游离的Gen,3h后NO-G基本完全分解;在模拟小肠液环境(pH6.8)下,3h内NO-G含量无明显改变。而对于体外培养的细胞,给药30min后在细胞内能够同时检测到NO-G和Gen。4. NO-G与MC3T3-E1细胞共孵育后能够缓慢释放出NO,释放时间可持续5h左右。5. NO-G能够促进OB的增殖,分化,并呈一定的时间、剂量依赖性;与原形药物相比,这些作用都有显著提高(P<0.05或0.01)。6. NO-G能够促进OB的矿化。细胞培养18d,有明显的矿化结节形成;定量分析结果显示NO-G能够有效促进OB的矿化(P<0.05 vs Gen, SNAP, and Gen+SNAP)结论:1.本课题设计的NO-G的结构具有缓慢释放NO的特性,其合成路线简单易实现,操作过程易于控制,产物纯度较高,产率适中。通过核磁、质谱和红外等波谱分析确证其结构为设计的系列结构之一;该化合物的结构未见文献报道。2.实验建立的HPLC分析方法条件稳定可靠,具有可重复性。在该色谱条件下能够同时检测出NO-G和Gen,可以实现Gen,NO-G和杂质峰的完全分离;保留时间适宜,且空白溶剂在该色谱条件下无特异吸收峰。3. NO-G在模拟胃液环境下产生分解;但在模拟小肠液环境下具有较好的稳定性。在体外与细胞共培养,大部分药物能够通过细胞膜进入细胞内,分解释放出Gen。4.与SNAP相比,NO-G在培养的细胞上能够缓慢释放出小剂量的NO。这可能是NO-G作用较Gen提高的药理学基础。5. NO-G呈时间、剂量依赖性地促进OB的增殖和分化,并能够有效促进矿化的形成,其效果均明显优于母体药物。NO-G有望成为一种新型的骨质疏松防治药物。