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研究背景中药成分复杂,一方一药往往难以得出规律性的认识,而药对虽组成简单却代表着系列衍生方的核心特征,蕴含着丰富的客观规律。现药对的研究多基于传统中医药理论,借助现代技术手段从体外化学成分、药理效应、药代动力学和代谢组学等角度剖析临床用药经验。本课题为麻黄类药对组成规律基础研究（国家自然科学基金重点项目）的部分内容,研究对象麻黄-石膏,性味相反,一温一寒、一升一降、一宣一清、虽相反而实相成,达仲景方中11首。在经方“麻杏石甘汤”中,麻黄-石膏（1:2）两药相配既能宣肺,又能泄热,主治肺热喘咳、身热不解,临床疗效确切。前期药理效应与代谢组学工作发现:麻黄-石膏1:2时解热、平喘优于1:1、1:4;麻黄-石膏合用和单用均能改善干酵母诱导发热大鼠全身异常代谢状态,其中合用后生物标志物的回调程度最大。目前国内外关于麻黄-石膏的实验研究主要集中于某一药效学指标,或水煎液中部分化学成分含量变化等方面,暂无针对该药对药物代谢动力学的报道,而这种核心药组的药动学相互作用所引起的药效变化恰是中药复方主要药效的前身。为此,源于麻黄-石膏合用“增效减毒”可能与体内药效/毒成分“动态变化”相关的设想,我们分析药对配伍对大鼠体内指标性成分血药浓度、组织分布、排泄行为的影响,试图从药动学角度阐释麻黄-石膏剂量配比的合理性与科学性。研究目的本研究为麻黄-石膏前期体外化学成分、药理效应与代谢组学工作的延伸,以麻黄、石膏的药效/毒成分为核心开展药物动力学研究,寻找量效、时效以及毒效之间的内在关系,进一步系统地验证、深化麻黄-石膏药对"相使用之"的配伍内涵。1.借助UPLC-MS/MS手段,探讨麻黄-石膏不同剂量配比（1:0,1:1,1:2,1:4）对自麻黄移行入血5种特征成分（去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱）药动学参数的影响;2.比较麻黄-石膏配伍前后上述麻黄类生物碱组织分布、排泄情况的变化;3.考察麻黄-石膏不同配比（1:0,0:2;2:2,1:2,0.5:2）对血清中3种元素（Ca、Na、Mg）时效药动学行为的影响;4.结合过去的研究成果综合分析,建立化学成分与药理效应、毒理效应之间的内在关系。研究方法麻杏石甘汤始见于《伤寒论》,曰:"麻黄四两（去节）;杏仁五十个,去皮尖;甘草二两,炙;石膏半斤。"本课题选取其中的经典药对麻黄-石膏,依据前期药/毒理实验结果,设计两药配比为1:0、1:1、1:2、1:4和0:1。1.麻黄-石膏不同配比对麻黄类生物碱血浆药动学的影响。建立UPLC-MS/MS同时测定大鼠血浆中去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱的含量。将SD大鼠分别灌胃给予单味麻黄（1:0）、麻黄-石膏（1:1、1:2、1:4,w/w）水煎液后,于给药前后特定时间点采集血样,采用所建立的方法测定血浆中5种麻黄类生物碱的含量,得到血药-时间曲线和相关药动学参数。分析石膏不同剂量变化对麻黄药效/毒成分药动学行为的影响,探讨其与麻黄-石膏不同配比下功效有所偏重的关系。2.麻黄-石膏配伍前后麻黄类生物碱的组织分布情况。建立UPLC-MS/MS定量分析大鼠组织中去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱的含量。将SD大鼠分别灌服单味麻黄（1:0）、麻黄-石膏（1:2,w/w）水煎液后,于特定时间点采集心、肝、脾、肺、肾和脑组织,测定组织样品中5种麻黄类生物碱的含量,比较配伍前后麻黄药效/毒成分在各组织分布及蓄积的情况,研究其与麻黄加入石膏后药效/毒强度改变的相关性。3.麻黄-石膏配伍前后麻黄类生物碱经尿及粪便的排泄特征。建立UPLC-MS/MS测定大鼠尿液和粪便中去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱的含量。将SD大鼠分别灌服单味麻黄（1:0）、麻黄-石膏（1:2,w/w）水煎液后,于特定时间段收集尿液和粪便,测定排泄物中5种麻黄类生物碱的含量,初步了解麻黄的体内代谢特点。4.麻黄-石膏不同配比对血清钙、钠、镁含量的影响。将SD大鼠分别灌胃给予单味麻黄（1:0）、单味石膏（0:2）、麻黄-石膏（2:2、1:2、0.5:2,w/w）水煎液后,于给药前后特定时间点采集血样,借助罗氏生化分析仪测定血清中Ca、Na和Mg的含量,得到相关浓度-时间曲线和时效药动学参数。分析麻黄剂量变化对血清中Ca、Na、Na/Ca、Mg水平的影响,摸索其与石膏-麻黄合用热解而不发汗的关系。5.数据分析。应用DAS 3.2.2软件,以非房室模型计算特征成分的药动学参数。借助SPSS 13.0统计软件,采用One-way ANOVA比较多组之间药动学参数的均值,以LSD法（方差齐性）与Games-Howell法（方差不齐）进行多重比较;运用独立样本t检验比较两组之间参数的均值;以重复测量数据的方差分析进行组织分布数据处理（p<0.05,具有统计学意义）。实验结果1.大鼠生物样品中去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱的定量分析方法。所建立的方法经专属性、线性范围、定量限、精密度、准确度、提取回收率、基质效应和稀释因子等考察,符合相关的体内分析要求。2.麻黄-石膏不同配比下麻黄类生物碱的血浆药动学行为。各组组内5种麻黄类生物碱的吸收趋势（AUC0-t/Dose）均为去甲基麻黄碱≈去甲基伪麻黄碱>麻黄碱≈伪麻黄碱≈甲基麻黄碱。组间的AUC0-t、tmax有显著差异（P<0.05）,但Cmax变化不明显（P>0.05）;其中与单味麻黄相比,成分去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱和麻黄碱在麻黄-石膏1:1与1:2时吸收程度下降（AUC0-t减少）,在麻黄-石膏1:2与1:4时吸收速率提高（tmax缩短）;伪麻黄碱和甲基麻黄碱虽存在上述变化但无统计学意义（P>0.05）。此外,在3个麻黄-石膏合用组中,随着石膏用量的加大,5种麻黄类生物碱的药动学变化整体表现为参数t1/2z、MRT、Vz/F逐渐增加,tmax、CLz/F逐渐减少。3.麻黄-石膏配伍前后麻黄类生物碱的组织分布情况。两组组内时间、部位因素均能影响生物碱的体内分布情况（P<0.05）;且时间与组织之间存在显著的交互效应（P<0.05）,同一成分在不同组织随时间的变化有所不同;组织分布量以肺、肾和脾居多。与单味麻黄相比,麻黄-石膏1:2时在肺脏成分麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱吸收加速（tmax缩短）、平衡相延长;在肾脏麻黄碱和伪麻黄亦有上述变化,且出现双峰现象;而在心脑器官麻黄碱的平衡相收窄,麻黄碱较伪麻黄碱占据的份额（AUC0-t（E）/AUC0-t（PE））缩小。4.麻黄-石膏配伍前后麻黄类生物碱经尿及粪便的排泄特征。组内5种生物碱的尿排泄率以去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱最大（达到80%98%）,其次为麻黄碱和伪麻黄碱,甲基麻黄碱最少（仅为4%～6%）。单味麻黄组的排泄速率最大值（Rmax）于02 h测得,麻黄-石膏1:2组在紧接的26 h出现;两组间同一成分的排泄率、排泄半衰期、最大排泄速率和排泄速率常数等尿排泄动力学参数比较接近（P>0.05）;仅麻黄-石膏1:2时甲基麻黄碱的排泄量高于单味麻黄（P<0.05）。相比之下,生物碱经粪便的排泄量较少,两组的总生物碱排泄率均不足1%,组间同一成分的排泄动力学参数无显著差异（P>0.05）。5.麻黄-石膏不同配比下血清中钙、钠、镁的水平变化。5组组间Ca、Na/Ca、Mg时效药动学参数的差异有统计学意义（P<0.05）,但Na的变化不明显（P>0.05）。其中与单味麻黄相比,麻黄-石膏1:2时,Ca的体内滞留时间（MRT）延长、分布体积（Vz/F）增加,Na/Ca与Mg的达峰浓度（Cmax）升高、MRT亦延长;单味石膏除Vz/F（Ca,Mg）外其余参数与单味麻黄无显著差异（P>0.05）。另外,在3个麻黄-石膏合用组（2:2,1:2,0.5:2）中,当两药比例1:2时元素体内水平呈高潮或低谷效应,表现为Ca的分布体积、Mg的达峰浓度与曲线下面积（AUC00-t）达到最大,Na/Ca的达峰浓度为最小值。实验结论1.本研究所建立的UPLC/MS-MS同时测定生物样品（血样、组织、排泄物等）中去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱的含量较以往的方法简便、灵敏、快速,适用于中药麻黄乃至含麻黄生物碱药品的体内成分监测,指导临床安全用药。2.石膏剂量的改变可对麻黄中药效/毒成分（去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱）的体内处置产生规律性影响。当麻黄-石膏1:2、1:4时,麻黄碱、伪麻黄碱与甲基麻黄碱比1:1组吸收速率加快、滞留时间延长,表观分布体积增加,吸收程度升高,生物利用度提高,与麻黄量少于石膏功效重在解热平喘相衔接。但临床清泻肺热时常用比例1:2,原因可能是1:4时去甲基麻黄碱、麻黄碱的药代特征趋于单味麻黄,而麻黄属"峻烈"之品,不良反应的发生率相应提高。当麻黄-石膏配比1:1时,伪麻黄碱与麻黄碱两成分间AUC0-t、Vz/F的比值均较麻黄-石膏1:2与单味麻黄低,前者占据份额提升,"此消彼长",平喘作用降低的同时利尿效应增强,实现麻黄量等于石膏重在发越水气（利尿）的目的。此外,麻黄配伍石膏后麻黄碱、去甲基麻黄碱的AUC0-t、Cmax减少,消除速率加快,一定程度上降低了毒副作用的风险。本研究从血浆药动学角度证实临床麻黄-石膏据"证"定"比"的科学性与合理性。3.麻黄-石膏配伍前后5种生物碱均对肺、肾和脾有明显的趋向性,其分布特点与麻黄、石膏归经理论相吻合。石膏的加入,可选择性地干预同一靶器官（肺、肾、心、脑等）中不同成分的蓄积行为,调节麻黄药效/毒成分群的比例,从而达到两药合用解热平喘"增效"、辛温峻烈"减毒"的目的。4.5种麻黄类生物碱主要经尿液排泄,处于转化链末端的去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱排泄率高达80%98%,始端的甲基麻黄碱仅为4%～6%;且5成分在尿液的存在比例与体外水煎液不同,由药物代谢的终端信息佐证了人们关于麻黄生物碱在体内遵循ME→E→NME、PE→NMP方向性转化的设想。同时,配伍石膏后生物碱经尿最大排泄速率的推迟可能由成分吸收入血速度加快、组织分布平衡相延长所引起。5.麻黄1/2倍量于石膏时,较单味麻黄、单味石膏、麻黄--石膏2:2和麻黄-石膏0.5:2组对血清中Ca（上调）、Na/Ca（下调）、Mg（上调）的千预效果最优,从血清元素角度解释麻黄-石膏1:2时热解而不发汗、无伤津之弊的配伍内涵。