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近来国内外学者用BMPs基因修饰骨种子细胞使其持续表达BMP并诱导自身向成骨细胞转化来修复大范围骨缺损。骨髓基质干细胞作为基因转染的靶细胞具有取材创伤小，较易培养的特点，但短期内细胞扩增量还难以满足临床上修复较大骨缺损的要求。寻找具有来源丰富、取材易且扩增迅速以备基因修饰的种子细胞，并与合适的支架材料相复合构建组织工程骨修复大范围骨缺损乃本文的最终目的。因此，本文分in vitro和ex vivo两部分研究rhBMP-2基因修饰骨骼肌干细胞体外诱导成骨分化和构建基因强化组织工程骨体内修复大范围骨缺损的作用，为临床修复较大骨缺损寻找一种新的途径。 实验一 rhBMP-2基因转染的兔骨骼肌干 细胞体外诱导成骨的实验研究 目的 评价腺病毒介导的重组人骨形态发生蛋白(Adv-rhBMP-2)基因对兔骨骼肌干细胞(Skeletal Muscle Stem Cells，SMSCs)体外成骨活性的影响；初步探讨阳离子脂质体介导rhBMP-2转染SMSCs的可行性。方法(1)腺病毒介导的基因转染和检测方法 在293细胞内扩增Adv-rhBMP-2及Adv-GFP，并用空斑形成实验测定滴度。实验分为三组：Ⅰ、Adv-rhBMP-2转染细胞组；Ⅱ、Adv-GFP转染细胞组；Ⅲ、未转染细胞组。①从兔后肢股部骨骼肌内分离培养的干细胞经腺病毒转染后(MOI=50)观察转染率和转染后细胞生物学的变化。②腺病毒编码的rhBMP-2基因转染SMSCs后检测rhBMP-2、碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原和骨钙素的表达及钙结节的形成。(2)脂质体介导的基因转染和检测方法 pEGFP-rhBMP-2的扩增、浓度及纯度鉴定。①脂质体包裹质粒DNA，转染SMSCs后测定转染率。②检测 博士学位论文 军医进修学院rhBMP－2、ALP和 1型胶原的表达。结果 门）腺病毒介导的基因转染后的检测结果①腺病毒基因转染率为79彻 SMSCS转染基因后3日增殖减慢，然后缓慢上升，7日进入增殖平缓期。②转染后第4天，免疫组化染色显示Ady—rhBMP－2转染细胞组rhBMP－2（＋＋）、ALP（＋＋）、I型胶原（＋＋），其它两组染色弱阳性（士）。③rhBMP－2活性定量检测 Ady－rhBMP－2转染细胞后 l－3天即开始表达 rhBMP－2，13－15天达高峰，19－21天表达量明显减少。④ALP活性定量检测及骨钙素测定 Ady－rhBffe－2转染后第 5天 ALP分泌量及骨钙素含量明显高于其他两组，差异有显著性（P＜0．05）。⑤诗素红染色 ＊－rhBMP－2转染后第 21天染色显示钙结节，其它两组未见钙结节形成。（2）脂质体介导的基因转染后的检测结果①脂质体介导pAGFP一rhBMP－2转染SMSCs后所测定的最大转染率为14．18％。②pAGFP—rhBhe－2转染的SMSCs中rhBMP－2、ALP和1型胶原的表达呈阳性，而pAGFP转染的细胞和未染细胞 rhBMP－2、ALP和 1型胶原的表达弱阳性。结论（l）SMSCs取材易、来源广、增殖迅速。（）Ady－rhBMP－2基因转染率较高，经其转染SMSCS有较强的诱导成骨能力，可成为一种新颖的修复大范围骨缺损的治疗方法。（3）脂质体介导质粒rhBMP－2的基因转移安全性好，但转染率相对较低，随着新一代高转染率脂质体的问世，这种治疗方法有望率先进入临床。 实验二 AdrhBMP—2转染肌肉干细胞 体内诱导成骨的实验研究 ． 目 的 探索＊－rhBMP－2修饰的SMSCs作为种子细胞、DBM作为支架材料 构建组织工程化人工骨异位成骨及修复兔挠骨大段骨缺损的可行性。 方法①裸鼠肌内诱导成骨：分为三组：1．AdrhBpp《转染S眺Cs侣DBM 组；11．SDBM组；Ill．AdBMP－2转染SMSCS组。将3组植入探鼠肌内进行 诱导成骨实验。②修复兔校骨干骨缺损（20mm）：50只新西兰兔，分为 54 博士学位论文 军医进修学院 组，每组 10 ／q。I、Ady－rhBMP－2转染 SMSCs／DBM组，11、Ady－GFP转染 SMSCS／DBM组，Ill、未转染 SMSCS／DBM组，w、单纯mM组，V、未治疗 组。于4、6、周分别行骨密度、X线、生物力学及组织学检查。结果① 肌内成骨实验：3周后1组及＊组可见有骨样组织形成，11组未见骨样组 织形成。②修复兔挠骨干骨缺损门0mm）：4周，Ady寸hBWi《转染 SMSCs 组骨修复达到X线愈合标准，但髓腔不通；6周，l、11、Ill、IV、V组 的愈合率，分别为 6／6、3／6、2／6、0／6、0／6。结 论 ＊－rhBMP－2修饰 的SMSCS作为种于细胞、DBM作为支架材料构建的基因强化组织工程骨可 以诱导裸鼠肌内异位成骨并能修复兔挠骨长20毫米的大段骨缺损，为临床 上大范围骨缺损的修复提供一种更为有效的方法和材料。