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实验背景:肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全世界范围内与癌症相关的最常见的死亡原因之一。通常情况下,肝癌患者早期没有明显症状,被诊断时多已发展到晚期阶段,已不适合手术治疗。因此,晚期肝癌治疗方法的选择受到了极大的限制。此外,由于术后复发率及转移率较高,肝癌患者的五年存活率仍然不能令人满意。因此,认识肝癌转移的作用机制对肝癌的治疗具有非常重要的指导意义。多胺是一类在哺乳动物细胞中含量丰富,参与细胞生长、分化等生理过程且发挥关键作用的生物小分子,包括腐胺(Putrescine,PUT),亚精胺(Spermidine,SPD),以及精胺(Spermine,SPM)。已有大量文献表明肿瘤的发生发展与多胺的含量具有相关性。因此,多胺是一个十分有潜力的抗肿瘤靶点。精胺/亚精胺N~1-乙酰转移酶(Spermidine/spermine N~1-acetyltransferase,SSAT)是真核细胞中多胺分解代谢的限速酶,是维持多胺浓度平衡的关键酶。但是目前SSAT在肝癌中具体的生物学功能及作用机制仍然不清楚。实验目的:以3种肝癌细胞(SMMC7721、Hep G2、Bel7402)为实验对象,探讨SSAT对肝癌细胞的影响及其分子机制。实验方法:采用Western blotting实验方法检测3种肝癌细胞SMMC7721、Hep G2和Bel7402中SSAT蛋白的表达情况;采用转染的实验方法构建SSAT稳定高表达的SMMC7721、Hep G2细胞株,以及SSAT敲减的Bel7402细胞株;使用高效液相色谱法检测SSAT对肝癌细胞内多胺含量的影响;使用MTT和克隆形成实验方法检测SSAT对肝癌细胞增殖和克隆形成能力的影响;使用伤口愈合实验和铺有Matrigel的Chamber transwell实验检测SSAT对肝癌细胞的迁移和侵袭能力的影响;使用Western blotting实验检测AKT/GSK-3β/β-catenin通路蛋白的变化;使用高效液相色谱法检测外加多胺对肝癌细胞中多胺含量的改变,并使用Western blotting实验检测外加多胺是否影响AKT/GSK-3β/β-catenin通路蛋白的变化;LiCl抑制GSK-3β后,使用铺有Matrigel的Chamber transwell实验检测肝癌细胞的迁移和侵袭能力,并使用Western blotting检测β-catenin及下游蛋白的表达情况。实验结果:1、Western blotting实验结果发现SMMC7721、Hep G2中SSAT表达含量较低,而Bel7402中较高。在此基础上我们转染并使用Western blotting验证,成功构建了SSAT高表达的SMMC7721、Hep G2细胞株,以及SSAT敲减的Bel7402细胞株。HPLC实验发现SSAT高表达可以显著下调肝癌细胞中多胺的含量。而SSAT敲减后,多胺含量上升;2、MTT和克隆形成实验发现SSAT可以显著抑制肝癌细胞的增殖和克隆形成能力;3、伤口愈合实验和铺有Matrigel的Chamber transwell实验发现SSAT可以抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力;4、Western blotting实验结果发现SSAT表达增加,AKT表达降低,且磷酸化减少。GSK-3β磷酸化也降低。而SSAT表达下降,结果相反;进一步实验发现SSAT高表达,β-catenin、Cyclin D1、以及N-cadherin蛋白表达下调,而E-cadherin上调;5、外源性多胺作用后,SSAT高表达的SMMC7721、Hep G2细胞中多胺含量上升,基本与未转染SSAT的空白对照中多胺含量相当。Western blotting检测结果表明AKT、GSK-3β以及β-catenin蛋白水平出现逆转;6、GSK-3β抑制剂LiCl作用后,SSAT对细胞的抑制侵袭作用明显降低。Western blotting的结果发现β-catenin的蛋白水平随着p-GSK-3β的升高而上调。实验结论:SSAT通过降低肝癌细胞中的多胺含量,经由AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力。