研究背景结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率分别位居所有恶性肿瘤的第三位和第二位。目前,CRC的治疗方法包含手术切除、化疗、放疗、免疫治疗等多种方式。但由于缺乏理想的治疗靶点,患者生存率提高并不显著,急需挖掘精准的治疗靶点。CRC的快速增殖和转移是导致患者预后不良的主要因素,多项研究表明,环状RNA（circular RNA,circRNA）在肿瘤增殖和转移过程中扮演重要角色。CircRNA的闭合环状结构使其更加稳定,广泛而多样地存在于真核细胞中,具有组织特异性,疾病特异性以及时空特异性,这意味着circRNA具备成为理想治疗靶点的特征。然而,其临床意义、调控作用和潜在机制仍在很大程度上未知,探索关键circRNA在CRC中的作用及机制对治疗肿瘤相关疾病具有重要意义。研究目的通过筛选新的circRNA并检测其在CRC组织和血清的表达情况,为挖掘CRC的潜在诊断标志物提供线索。CRC的快速增殖和转移严重影响患者预后,急需更深层次探讨其复杂的调控机制。通过挖掘新的circRNA并揭示其调控CRC进展的功能和机制,有利于靶向药物的研发及肿瘤复发转移的控制,为CRC的治疗提供理论依据。第一部分Circ4953的筛选及表达情况研究方法1.采用高通量测序检测4对CRC组织和癌旁对照组织中circRNA表达谱。2.以差异倍数绝对值＞2.0和P＜0.05作为筛选条件选出差异表达的circRNA。3.依据circRNA在28对CRC和癌旁对照组织中的表达情况筛选目标circRNA。4.采用qRT-PCR检测circRNA在40对CRC和癌旁对照组织中的表达以及19例CRC和19例健康对照血清中的表达。5.采用原位杂交（In situ hybridization,ISH）检测circRNA在CRC组织切片中的表达。根据原位杂交结果分析circRNA表达对患者生存以及淋巴结转移情况的的影响。研究结果1.高通量测序结果表明CRC组织和癌旁对照组织中circRNA表达谱存在差异。2.以差异倍数绝对值＞2.0和P＜0.05为筛选标准,筛选出33个在CRC中显著上调的和47个显著下调的circRNA。依据文献以及NCBI基因注释,选择亲本基因具有促进CRC增殖转移功能的8个circRNA。3.基于28对CRC及癌旁对照组织中circRNA的表达情况,选定显著上调的 circ4953。4.Circ4953在CRC细胞和组织中显著上调,在早期CRC患者血清中显著上调。5.基于原位杂交评分的生存分析表明,circ4953高表达不利于CRC患者的预后,且circ4953高表达患者发生淋巴结转移的比例较高。第二部分Circ4953的环状鉴定与细胞定位研究方法1.采用跨连接位点的引物（divergent primers）对HCT116细胞中的circ4953进行扩增,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,条带回收,进行Sanger测序,验证circ4953的闭合环状结构。2.采用不跨连接位点的引物（convergent primers）和跨连接位点的引物（divergent primers）分别在gDNA水平和cDNA水平扩增circ4953,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,验证circ4953的闭合环状结构。3.采用qRT-PCR及核酸电泳检测circ4953及其线性转录本对核糖核酸外切酶（RNase R）的耐受程度。4.采用放线菌素D实验检测circ4953的稳定性。5.采用核浆分离实验分别提取细胞核和细胞浆中的RNA,进行反转录和qRT-PCR,比较circ4953在细胞浆以及细胞核中的分布情况。6.采用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）技术,用荧光标记的circ4953特异性探针孵育SW480细胞,经激光共聚焦显微镜成像观察circ4953的细胞定位。研究结果1.Sanger测序确认circ4953序列与RNAseq和exoRBase数据库的注释一致,表明circ4953是闭合环状结构。2.Convergent primers在gDNA水平和cDNA水平都能扩出条带。Divergent primers引物仅能在cDNA水平扩出条带,gDNA水平则不能有效扩增,证实了circ4953的闭合环状结构。3.SW480细胞提取的总RNA经RNase R消化后,circ4953下降缓慢,而其对应的线性转录本AURKA迅速下降,表明circ4953对RNase R耐受能力强。4.放线菌素D孵育SW480细胞后,随着时间推移,线性转录本AURKA降解较快,而circ4953表现出良好的稳定性。5.RNA核浆分离实验结果表明,在HCT116、SW480和DLD-1细胞中,circ4953在胞浆以及胞核中都有分布,胞浆中偏多。6.FISH实验表明,在SW480细胞中,circ4953在胞浆胞核中都有分布,胞浆中偏多。第三部分Circ4953的生物学功能研究方法1.采用克隆形成实验,观察干扰或过表达circ4953对HCT116和SW480细胞集落形成能力的影响。2.采用EdU实验,观察干扰或过表达circ4953对HCT116和SW480细胞增殖能力的影响。3.采用Transwell实验,观察干扰或过表达circ4953对HCT116和SW480细胞迁移和侵袭能力的影响。4.采用慢病毒转染HCT116细胞,构建稳定过表达circ4953的细胞株和对照细胞株,构建裸鼠皮下移植瘤模型,比较两组裸鼠皮下移植瘤的体积。5.采用稳定过表达circ4953细胞及对照细胞构建裸鼠尾静脉转移模型,观察CRC细胞在裸鼠体内的转移情况。研究结果1.克隆形成实验表明,干扰或过表达circ4953分别显著降低或增高了HCT116和SW480细胞的克隆形成能力。2.EdU实验表明,干扰或过表达circ4953分别显著降低或增高了 HCT116和SW480细胞的EdU阳性细胞率。3.Transwell实验表明,干扰和过表达circ4953分别抑制或促进HCT116和SW480细胞的迁移和侵袭能力。4.裸鼠异种移植瘤模型表明,过表达circ4953组的移植瘤体积显著高于对照组,表明circ4953促进CRC生长。5.裸鼠尾静脉转移模型表明circ4953促进CRC细胞在体内转移。第四部分Circ4953发挥功能的分子机制探索研究方法1.转录组测序挖掘circ4953的下游效应分子。2.流式细胞术检测circ4953对CRC细胞周期的影响。3.Pulldown、质谱以及RNA免疫沉淀（RIP）实验,挖掘circ4953的RNA结合蛋白。4.采用siRNA、过表达质粒、ATP和乙酰辅酶A检测实验探索circ4953对ACLY蛋白水平及催化活性的影响。5.采用siRNA以及Western blot检测circ4953对CTNNB1蛋白水平的影响。6.采用放线菌酮（CHX）处理HCT116细胞,观察干扰circ4953对CTNNB1蛋白稳定性的影响。7.采用IP实验检测circ4953对于CTNNB1蛋白泛素化水平的影响。8.采用CO-IP实验检测ACLY蛋白与CTNNB1之间的相互作用,以及circ4953对于两者相互作用的影响。9.补救实验联合IP实验,探索circ4953是否通过促进ACLY与CTNNB1的关联从而阻止CTNNB1蛋白降解。研究结果1.转录组测序经qRT-PCR验证,确认干扰circ4953引起CCND1水平显著降低。2.细胞周期检测结果表明干扰circ4953造成CRC细胞G1期阻滞,可能与干扰circ4953引起的CCND1 下降有关。3.Pull down、质谱及RIP实验表明circ4953能够与ACLY和CTNNB1蛋白结合,表明ACLY和CTNNB1可能是circ4953的下游分子。4.Circ4953对ACLY蛋白水平及催化活性影响不明显。5.干扰circ4953后,CTNNB1的蛋白水平显著下降。6.CHX抑制蛋白合成后,干扰circ4953组的CTNNB1蛋白降解速度较快。7.过表达circ4953引起CTNNB1蛋白泛素化水平降低,表明circ4953抑制CTNNB1的降解。8.CO-IP实验表明circ4953促进ACLY和CTNNB 1蛋白的相互作用。9.补救实验联合IP实验结果表明,circ4953通过促进ACLY与CTNNB1的关联从而阻止CTNNB1蛋白降解。第五部分Circ4953依赖CTNNB1促进CRC进展研究方法1.通过siRNA和过表达质粒构建补救实验的三个分组:对照组,过表达circ4953组以及过表达circ4953基础上干扰CTNNB1组。2.补救实验不同组别细胞的增殖能力通过克隆形成和EdU实验测定。3.补救实验不同组别细胞的迁移侵袭能力通过Transwell小室测定。4.采用慢病毒转染HCT116细胞,构建用于补救实验的三株稳定转染细胞系,分别为:对照细胞系,过表达circ4953的细胞系以及过表达circ4953同时干扰CTNNB1的细胞系。采用以上三株细胞构建裸鼠异种移植瘤模型,比较三组裸鼠背部皮下移植瘤的体积。并采用qRT-PCR,Western blot,IHC检测下游关键分子在各组中的表达情况。5.采用以上三株细胞构建裸鼠尾静脉转移瘤模型。通过体内荧光成像技术,比较三组裸鼠肺部转移灶的荧光强度。HE染色用于观察三组裸鼠肺部转移性结节。研究结果1.转染过表达质粒后circ4953表达水平显著升高,转染siRNA后CTNNB1的表达水平显著降低。2.在HCT116和SW480细胞系中,过表达circ4953引起的细胞增殖能力的增强,可以通过干扰CTNNB1逆转。说明circ4953促进CRC细胞增殖的功能依赖于CTNNB1。3.在HCT116和SW480细胞系中,过表达circ4953引起的迁移侵袭细胞数的增多,可以通过干扰CTNNB1逆转。说明circ4953促进CRC细胞迁移侵袭能力依赖于CTNNB1。4.Circ4953在裸鼠体内促进CRC肿瘤生长的功能能够通过干扰CTNNB1逆转。过表达circ4953引起的下游效应分子（CCND1,c-myc）的上调依赖于CTNNB1。5.Circ4953在裸鼠体内增强CRC细胞发生肺转移的能力,能够通过干扰CTNNB1逆转。HE染色和全景扫描图像显示,过表达circ4953引起裸鼠肺部转移灶增加,该现象在干扰CTNNB1后显著减少。研究结论1.Circ4953在CRC细胞,CRC组织以及CRC患者血清中显著上调。2.Circ4953在体内外均能促进CRC增殖转移。3.Circ4953通过抑制CTNNB1蛋白降解从而促进结直肠肿瘤进展。