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捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是毛圆科(Trachostrongylidae)血矛属(Haemonchus)消化道线虫，感染牛、绵羊、山羊及其他反刍动物，引起动物贫血及贫血综合征，严重的可致动物，特别是羔羊大批死亡，给畜牧业生产带来巨大经济损失。目前，主要采用化学药物治疗该病，但药物残留严重，加之抗药性虫株的出现和蔓延，使得化学治疗方法受到了严重挑战。应用免疫学方法防治该病十分迫切和必要。 捻转血矛线虫H11抗原是一种跨膜糖蛋白，分布于吸血阶段虫体的小肠微绒毛上皮细胞。天然H11具有良好的免疫保护作用，免疫动物后，可使雄虫减少70％、雌虫减少80％、虫卵减少90％，是优良的基因工程疫苗候选抗原，国外已在GenBank中注册了该抗原基因的全序列，然而国內尚无相关资料报道。本文主要进行了以下工作： 1．捻转血矛线虫H11抗原cDNA基因克隆、鉴定及特性分析 根据GenBank中发表的捻转血矛线虫H11基因序列，设计3对引物。以山羊捻转血矛线虫成虫总RNA为模板，采用RT-PCR技术，分别扩增出大小约为940、1000、1200bp的产物。回收目的片段并克隆入pMD18-T载体，通过限制性內切酶酶切反应、PCR、序列测定等方法对重组子进行鉴定。测序结果发现H11 ORF由2919个碱基，972个氨基酸构成．生物软件分析表明，H11基因和GenBank中的捻转血矛线虫氨基肽酶(H11)同源性高达98％、与秀丽新杆线虫肽酶M1家族同源性为61％且具有氨基肽酶特征性基序HEXXH和GAMEN。文中还对该抗原的二级结构和抗原性进行了预测和分析。 2．捻转血矛线虫H11基因原核表达及重组蛋白酶活性分析 分别将H11-1、2、3基因亚克隆到原核表达载体pET-28 b(+)，双酶切和PCR鉴定筛选出阳性重组质粒。IPTG诱导后，SDS-PAGE分析发现重组H11-1、2蛋白进行了表达，且以包涵体形式存在。重组蛋白变性、复性、纯化后，通过测定分解氨基肽酶底物的能力及对酶抑制剂敏感性试验发现重组H11具有氨基肽酶活性，且酶活性不被EDTA和PMSF所抑制。捻转血矛线虫Hll抗原cDNA基因克隆、表达及山羊免疫保护性试验3.捻转血矛线虫重组Hn杭原山羊免疫保护性试脸 将重组Hll一1、Hll一2、Hll一卜2分别免疫山羊后，EUSA检测结果表明血清抗体均在首次免疫后14天达到较高水平，在二次免疫后10天达到高峰。10 000只捻转血矛线虫第三期幼虫攻击后，半定量PCR检测发现，外周血淋巴细胞IL一2、IL一4和IFN一丫表达水平在感染前、感染后不同时间无明显差异。对不同免疫组山羊排出虫卵数、虫卵孵化率和成虫数进行统计分析，结果表明免疫组与对照组间差异不显著，但免疫组雌虫数显著少于对照组，这对防治捻转血矛线虫病将起到一定的作用.4.重组捻转血矛线虫Hll基因在巴斯德毕赤酵母中表达 将捻转血矛线虫Hn基因亚克隆到酵母表达载体pPICz aB后，氛化钗法转化毕赤酵母菌株X一33，构建表达Hn的酵母基因工程菌.甲醇诱导后，通过RT一PCR和western Blot方法检测表明，捻转血矛线虫Hll在毕赤酵母中实现了表达.5.捻转血矛线虫Hn基因和山羊IL一2基因在巴斯德毕赤酵母中融合表达 将捻转血矛线虫Hll基因和山羊IL一2基因亚克隆到酵母表达载体pPICZaA后，氛化枉法转化毕赤酵母菌株X一33，构建融合表达Hll一IL一2的酵母基因工程菌.甲醇诱导后，RT一PCR检测表明目的基因在诱导后进行了转录，但SDS一PAGE和Westem Blot方法未检测到融合蛋白.6.捻转血矛线虫Hn基因疚苗的构建及山羊免疚保护性试脸 将捻转血矛线虫Hll基因分Hll一1、2、3三部分，分别亚克隆到基因疫苗载体pcDNA4/Hi 5 MaxC中，通过双酶切反应、序列测定等方法鉴定出重组疫苗.为进一步分析该基因疫苗的免疚保护性，将纯化的重组质粒肌注免疫山羊后，利用RT一PeR、w。5 t ern BI。t、ELIs^等方法进行检测，结果表明重组疫苗载体在山羊肌肉获得了表达，并产生了杭Hn杭体.免疚4周后，每只山羊攻击10000只捻转血矛线虫第三期幼虫，结果发现，与对照组比较，免疫组山羊排出虫卵减少58.75%、虫卵孵化率减少72.57%、成虫减少“.25%.说明Hll基因疫苗具有较好的免疚保护效果.关键词:山羊; 疫苗;捻转血矛线虫;Hll;序列分析;原核表达;酵母表达;基因免疚保护