绝大多数肿瘤特别是实体瘤细胞常表现为染色体不稳定性(通常体现为整条染色体的获得或缺失,即染色体非整倍体等)；非整倍体,指的是细胞中染色体数目发生了改变；染色体不稳定性,指的是染色体获得或丢失的频率,是一种速率(细胞内染色体以很高的速率发生变化),两者都被认为是肿瘤发生发展的重要推动力；肿瘤中非整倍体细胞的比例与肿瘤的恶化进程、转移风险、治疗效果以及复发率等密切相关。事实上,在癌症以及癌细胞体外培养的发生发展中,非整倍体细胞和染色体不稳定与之有着何种关系,到目前为止其内在的机理仍不清楚。提出了许多假说,其中有的甚至是相互对立的假说,都试图解开两者之间的关系。比如,落后染色体和染色体桥都会在细胞分裂过程中造成遗传物质发生丢失,从而造成染色体不稳定和非整倍体细胞的出现；确保染色体正确复制和分离过程的基因(其中包括：细胞周期检测点、纺锤体检测点、姊妹染色单体粘合、着丝粒/动粒的结构和功能、中心体与微管形成等等基因)在细胞传代过程中累积损伤发生改变也会导致染色体的不正确分配,从而造成染色体不稳定和非整倍体细胞的增多。这些机理都试图阐明其是染色体不稳定和非整倍体真正机理。但上述细胞分裂错误是否能真正产生非整倍体细胞以及非整倍体细胞假设真的产生后其命运如何?染色体不稳定的发生途径到底有哪些以及各种途径产生的频率如何?这些问题则仍需实验来阐明。在本研究中,我们选取3种结肠直肠癌细胞系,其中,HT29、SW480染色体不稳定(CIN), HCT116染色体稳定(Non-CIN);用脂质体转染法把绿色荧光蛋白H2B-GFP转入细胞；有限稀释法在三种细胞系中建立了单克隆,随机选取9个单克隆(每种细胞系3个)连续传代到60代,每隔10代对每个单克隆的细胞用着丝粒特异的探针进行荧光原位杂交,分析其染色体组成。由于是每隔一定代数来分析染色体组成,相当于对细胞动态生长过程的连续追踪。这样很容易知道染色体不稳定发生在哪个阶段,各个阶段发生的频率分别是多少。同时用胞质阻断微核实验法(CBMN)结合FISH来分析选择细胞克隆和代数的染色体丢失和染色体不分离。我们还选择了染色体不稳定发生最剧烈的克隆和代数进行长时间活细胞摄影结合荧光原位杂交进行分析,由于利用长时程活细胞实时摄影能观察细胞的实时分裂过程,同时结合荧光原位杂交(FISH)来检测活细胞摄影结束后各个子细胞的染色体组成,从而能极其精确的确定各非整倍体细胞的来源。我们利用长时间活细胞实时摄影、荧光原位杂交(FISH)和免灾荧光染色等技术,探讨结肠直肠癌染色体不稳定的发生途径，以期阐明染色体不稳定的细胞核分子生物学机制。主要实验结果如下：染色体不稳定细胞和染色体稳定细胞的区别包括：1)、在染色体不稳定(CIN)的细胞系SW480和HT29中,染色体桥的比例明显高于微卫星不稳定(MIN)的细胞系HCT116；2)、落后染色体,主要指在染色体分离过程中后、末期的落后染色体,不包括染色体向赤道板聚集过程中的前中期和中期落后染色体,同样是染色体不稳定细胞系明显高于染色体稳定细胞系；3)、染色体不分离,在染色体稳定以及不稳定的细胞系中均有一定的比例,且比例都较低,它们之间没有明显的差异；4)、微核在一种染色体不稳定的细胞系(SW480)中十分普遍,但另一种染色体不稳定的细胞系(HT29)以及染色体稳定的细胞系(HCT116)中比例非常低；5)、在染色体不稳定的细胞系中多极分裂的比例明显比染色体稳定的细胞中高,多极分裂将会大大增加细胞中的染色体随机不均等分配,导致大量的子细胞由于得不到足够的遗传物质而死亡,极大的增加了染色体不稳定的几率；但有趣的是,有极少数多极分裂的子细胞由于选择性而被保留了下来,具备形成克隆的能力；相比较它的母细胞而言,在群体生长中可能还具备优势；6)、细胞周期不同,在染色体不稳定的单克隆细胞中,同一克隆内不同核型的细胞在群体生长过程中,极少数由多极分裂产生的新的核型子细胞的增殖速度明显比母细胞快。染色体不稳定细胞和染色体稳定细胞间有如此众多的不同,染色体不稳定的发生有无主要的途径?如果有的话是什么途径?通过对结肠直肠癌细胞单克隆的细胞分裂过程和子细胞核型深入细致的研究,我们发现,在染色体稳定和不稳定的细胞系中,大于83%的新产生的非整倍体细胞是从单克隆建立后细胞分裂时多极分裂造成的,双极分裂染色体不分离的比例在染色体稳定细胞和不稳定细胞中的比例分别为8.4%和16.7%。在染色体不稳定的细胞中,落后染色体和染色体桥的比率是染色体稳定细胞系的2—5倍,但是通过FISH检测细胞染色体的组成情况后我们发现,含有落后染色体和染色体桥的细胞其子细胞染色体出现有别于母细胞的比率极低(在我们统计的所有细胞中只有一个)；而且,统计子细胞中的微核——一个染色体丢失的指标,发现其在染色体稳定和不稳定的细胞中比率没有显著差异。多极分裂的母细胞即可以是单核细胞也可以是双核细胞,其分裂后产生的子细胞的核型是多种多样的,大多数子细胞在随后的生长过程中或凋亡或停滞,只有极少数特定核型(和母细胞核型一致或者少一条特定染色体)的细胞可以形成克隆。多极分裂的子细胞能够存活下来,同时能够克隆化生长同样在我们的克隆形成实验中得到证实。药物处理实验同样说明了通过多极分裂产生的特定核型的子细胞在克隆形成过程中能引起核型发生巨大变化,且由多极分裂产生的新的核型子细胞的增殖速度明显比母细胞快,这样在群体生长环境下,会导致新产生核型的子细胞在一段相当的时间内逐渐增多而母细胞核型的细胞比例逐渐下降。我们的研究发现了染色体不稳定对于不同的克隆,其演变的趋势不尽相同,在不同的阶段,演化的速率也是变化的；我们还系统的比较了结肠直肠癌细胞系染色体不稳定产生的各种途径,阐明了结肠直肠癌细胞中染色体不稳定的最主要途径是通过多极分裂产生有别于母细胞核型的子细胞造成的。特定核型的子细胞在以后的群体生长中还获得生长繁殖优势,在一定培养时间范围促使群体细胞的染色体组成发生更大变化,从而加剧细胞的染色体不稳定性。染色体不稳定的发生是这些因素共同作用、协同发生的结果。