肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在我国是最为常见的恶性肿瘤之一,已有的人群研究资料和实验研究资料证明:HCC的发生与发展主要与慢性乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)以及慢性丙肝病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染相关,流行病学研究资料显示:我国HCC发生的原因主要是由于慢性乙肝病毒感染所导致。目前来说,对于早期的HCC患者,主要的治疗手段仍然以手术切除为主,对于一些无法进行手术治疗的患者,多采用介入疗法、化疗或放疗,但这些非手术治疗的效果并不令人满意。据报道,目前我国肝癌患者的5年相对生存率相对较低,仅为12.1%。对HCC患者进行一线治疗药物索拉菲尼(sorafenib)治疗后如果没有效果的话,美国FDA最近批准了采用PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂治疗,或口服多激酶抑制剂瑞戈非尼(regorafenib)进行治疗。在临床上,已经应用PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂进行了多种肿瘤的治疗,其治疗原理是通过逆转抗肿瘤免疫细胞的抑制作用而发挥有效的抗肿瘤免疫作用。在肝癌组织中通常有大量的免疫细胞浸润,然而,目前已有的临床数据表明:仅有一部分HCC患者(17%)在免疫检查点抑制剂治疗后获益。由此可以推测,在肝癌组织中已存在的大量浸润的免疫细胞中,很可能缺乏针对肿瘤细胞所表达的肿瘤抗原的特异性。近年来,随着基因组学和生物信息学的发展,采用个体化肿瘤新抗原(neoantigen)来制备肿瘤疫苗的设想逐渐成为可能。此种治疗的最终目的是,诱导机体产生针对肿瘤细胞所表达的肿瘤新抗原、具有杀伤肿瘤细胞作用的特异性CD8+T细胞,即特异性杀伤细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL),由此达到清除肿瘤细胞的目标。肿瘤新抗原是指在肿瘤细胞发生体细胞突变后产生的、仅表达在肿瘤组织中的抗原成分,肿瘤新抗原由于未经过胸腺选择过程而规避了免疫耐受,具有高免疫原性和特异性,能诱导出有效的抗肿瘤特异性细胞免疫应答,产生有效的CTL。近年来,针对肿瘤新抗原开展的免疫治疗性试验逐渐增多,主要围绕黑色素瘤等具有体细胞高突变负荷的肿瘤进行,采用肿瘤新抗原针对HCC的治疗性试验,目前尚未见报道。本研究试图寻找HCC突变相关的肿瘤新抗原,确定其具有诱导产生CD8+特异性杀伤细胞的能力,对表达相应抗原的肿瘤细胞有特异性作用,但是对机体自身正常细胞无损伤作用,由此为采用肿瘤新抗原进行HCC的免疫治疗提供理论依据。实验室前期对收集自江苏启东的49例HCC患者的肿瘤组织及配对正常组织进行了全基因组和外显子测序(Gastroenterology 2017;153:249-262)。在本研究中,我们根据已有的测序数据,分析了可能成为突变相关肿瘤新抗原的体细胞突变位点。由于肿瘤基因组在发生体细胞突变后,可改变正常表达的相关蛋白水平,在肿瘤组织中表达升高者,成为突变相关的肿瘤新抗原的意义更大。我们经过分析结果发现,在 HCC 组织中,TP53(tumor protein p53)的突变率为 40%,LAMA3(Laminin Subunit Alpha 3)的突变率为8%,有可能成为突变相关的肿瘤新抗原。进而,我们在GEO数据库中选取GSE25097进行分析,利用GPL10687平台统计TP53和LAMA3两个基因在肝癌肿瘤组织和非肿瘤组织中的表达差异。在GSE25097数据库中,TP53和LAMA3两个基因在肿瘤组织中的表达水平均高于正常组织(P<0.001)。随后,我们分析了 10例HCC患者的肿瘤组织和配对正常组织中上述两个基因产物的表达水平。提取肿瘤组织和配对正常组织的总RNA,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)分析TP5 与LAM3的mRNA 水平,采用免疫组化染色的方法,检测TP53与LAMA3蛋白的表达情况。分析后证实,上述10例HCC患者的肿瘤组织TP53和LAMA3的mRNA水平和P53蛋白及LAMA3蛋白表达水平均显著高于与之配对的正常组织。从而确定了突变的TP53和LAMA3具有作为肿瘤新抗原的可能性。根据已发表的文献报道,我们统计了中国人群的I类主要组织相容性抗原(Major Histocompatibility Complex molecules I,MHC-I)的基因亚型。结果发现,中国人主要的MHC-I分子亚型即HLA(human leucocyte antigen)A亚型为HLA-A2或HLA-A11或HLA-A24,三者所占比例总计约70%。在NCBI网站获取得到TP53和LAMA3相对应的氨基酸序列,截取我们前面分析中得到的突变位点及其前后10个氨基酸(共21个氨基酸)序列,利用软件NetMHC 4.0 Server对突变位点对应的氨基酸序列与HLA-A2、HLA-A11及HLA-A24三种MHC-I亚型进行结合能力的表位预测,设定百分比排名(%Rank)小于2的表位具有与相关HLA-A分子的结合能力。预测结果发现:TP53 R249S突变后及LAMA3R1603S突变后与某些HLA-A分子的结合能力升高,其中突变后的TP53和LAMA3与HLA-A2分子均具有高的结合能力,突变后的TP53与HLA-A11分子的结合能力升高,但突变后的TP53和LAMA3与HLA-A24分子的结合能力均未见提升。因此筛选出可能成为肝细胞癌突变相关肿瘤新抗原的表位是,TP53241-256:SCMGGMNRSPILTII(15aa)和LAMA31601-1613:VSSEELMTVLSRL(13aa)。人体研究的样本使用获得了中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会的批准,批号为NCC2015YZ-22。我们采用头颈部肿瘤患者手术治疗中清扫的局部淋巴结,分离得到新鲜的人淋巴细胞,采用PE标记的anti-human HLA-A2染色进行鉴定,利用合成预测得到的带有突变位点的肿瘤新抗原多肽,对5例为HLA-A2阳性标本进行肿瘤新抗原多肽相关CTL的诱导,并检测其对不同靶细胞,包括机体自身正常细胞的细胞毒作用。杀伤实验的靶细胞包括:1)负载带有突变位点的肿瘤新抗原合成多肽的174 × CEM.T2细胞;2)负载同一肽段带有正常非突变抗原多肽的174 ×CEM.T2细胞;3)同一患者外周血单个核细胞(自体正常细胞对照)。我们按照通用的计算公式计算效应细胞对每组细胞的杀伤能力:效应细胞的细胞毒活性(%)=(实验组靶细胞的死亡率-靶细胞的自然死亡率)/(100-靶细胞的自然死亡率)X 100%。结果发现:由肿瘤新抗原合成多肽诱导生成的CTL,对负载有此多肽的靶细胞有明显地杀伤作用,而对负载有同一肽段的正常多肽的靶细胞则未出现明显地杀伤作用,在任意固定效靶比条件下,同一多肽诱导的CTL对不同靶细胞的细胞毒作用进行比较,差别均具有统计学意(P<0.01)。其中在效靶比为10:1时和25:1时,来自突变TP53相应多肽诱导的CTL,对负载了突变位点合成多肽的靶细胞的细胞毒作用分别为14.6%±0.5%和19.6%±0.6%,对负载同一肽段非突变多肽的靶细胞的细胞毒作用分别为10.4%±0.4%和11.0%±0.4%。来自突变LAMA3相应多肽诱导的CTL,对负载了突变位点合成多肽的靶细胞的细胞毒作用分别为14.6%±0.9%和15.5%±1.4%,对负载同一肽段非突变多肽的靶细胞的细胞毒作用分别为8.6%±0.9%和10.8%±0.3%。除此之外,带有突变位点的肿瘤新抗原合成多肽诱导生成的CTL对自体正常细胞也未出现明显的杀伤作用,在效靶比为10:1时以及25:1时,TP53和LAMA3突变多肽所诱导的CTL均未对自体正常细胞产生杀伤作用,效应细胞的细胞毒作用均未超过5%。结论:1)TP53和LAMA3在HCC组织中存在较高突变率,并且其表达高于正常组织。2)TP53 R249S突变后及LAMA3 R1603S突变后与某些HLA-A分子的结合能力升高。其中TP53 R249S突变后与HLA-A2分子和HLA-A11分子结合能力升高;LAMA3 R1603S突变后与HLA-A2分子的结合能力有所提高。3)带有突变位点的肿瘤新抗原多肽TP53241-255:SCMGGMNRSPILTII(15aa)和LAMA31601-1613:VSSEELMTVLSRL(13aa)所诱导产生的CTL,对表达有该抗原的靶细胞具有特异性杀伤作用,但不产生针对机体正常细胞的细胞毒作用,有可能成为肝细胞癌突变相关肿瘤新抗原的表位。