背景:TRIM32(Tripartite motif-containing protein 32,TRIM32)是TRIM蛋白(Tripartite motif protein)家族中的一种,既是一种神经干细胞抑制相关蛋白又影响转录进程。环状结构域的存在使TRIM家族的大多数成员都具有E3泛素连接酶的活性,能够对特定的底物进行泛素化,这是它们发挥生物学功能的手段之一。生理学上,E3泛素连接酶控制机体的稳态、细胞周期以及几种DNA修复途径。E3泛素连接酶主要通过大量泛素修饰反应对靶标进行翻译后修饰,最终将泛素基耦联到靶底物上。Nicklas等报道TRIM32启动神经元的分化和自我更新,这种作用可被c-Myc转录因子的泛素化和某些micro RNAs的激活所抑制。在海马齿状回(dentate gyrus,DG)区内层的神经干细胞有较高的TRIM32蛋白水平,在神经干细胞发育成神经细胞或未成熟神经元时转移到DG外层,但在海马脑室下区(subventricular zone,SVZ)和DG中的神经干细胞未见TRIM32表达。这些报道提示神经干细胞分化时可见TRIM32表达的上调。另外,TRIM32参与神经发生、抑制神经细胞增殖和细胞凋亡,而且脑内很多蛋白分子的异常表达均与TRIM32上调或下调有关。许多神经系统疾病,例如抑郁症、焦虑症、阿尔茨海默病、自闭症和注意缺陷障碍的发生发展都与TRIM32的调节作用密切相关。学习记忆功能的障碍是许多神经疾病的共性,但是TRIM32缺乏对记忆的影响未见直接报道。有研究推测TRIM32的缺乏有可能引起突触可塑性改变损害学习和记忆功能,但是有关TRIM32对突触可塑性影响的确切报道至今未见。因此,本课题旨在研究TRIM32是否通过改变突触可塑性来影响学习和记忆。方法:本课题包括体内和体外实验两部分。用电生理学方法检测长时程增强(LTP)、输入/输出(I/O)曲线和双脉冲易化,以确定突触可塑性的变化。Western Blotting检测突触蛋白(Synaptophysin、Synapsin I、GAP-43、PSD95)、AMPA受体、NMDA受体、GABA受体、兴奋性和抑制性神经递质转运蛋白(EAAT2、SLC32A1)的表达水平。利用Western Blotting对Notch及其相关分子进行分析。免疫组织化学染色形态学观察相关蛋白的表达。RT-PCR和real-time PCR检测m RNA表达水平。采用Nissl染色法观察神经元数目的变化。高尔基染色来分析树突棘密度。宽频带(0.01-40000 Hz)记录神经元的电位信号,分析脉冲频率、局部场电位(LFPs)及各种振荡频宽(Delta、Theta、Alpha、Beta、Gamma)。同时,在体外实验中,在原代培养神经元上应用notch抑制剂DAPT梯度抑制notch,并使用上述一些技术验证其效果。统计分析采用不配对t检验分析两组间差异,采用单因素方差分析分析两组以上差异(Turkey’s post-hoc analysis分析比较差异)。结果:1、LTP为衡量突触可塑性的重要指标,在学习记忆中起着重要作用。高频刺激后诱导LTP,结果发现TRIM32敲除小鼠的局部场电位兴奋性突触后电位(f EPSP)的斜率和振幅较野生型小鼠相比显著降低(p<0.05)。输入/输出(I/O)曲线主要反映突触的基本传递效能,在本实验中TRIM32 KO型小鼠与野生型小鼠的I/O曲线无统计学差异,说明TRIM32基因敲除对小鼠神经元突触的基本传递效能未产生明显影响。双脉冲易化(PPF)是一种短时程突触可塑性模型。TRIM32基因敲除小鼠和野生型小鼠进行对比,PPF曲线无明显统计学差异,说明TRIM32的敲除不直接改变突触前膜的神经递质释放水平。2、树突棘的多少可以反应突触的形态可塑性。我们研究结果发现TRIM32敲除小鼠树突棘的平均数量是上调的,但是在海马CA1区域却是明显减少的。另外,TRIM32敲除小鼠的树突棘更纤细。说明TRIM32的敲除后突触形态可塑性减低。3、神经冲动传导过程中,突触前和突触后相关机制在LTP维持中被认为是非常重要的,首先我们观察了突触前及突触后标志分子的变化及神经递质及转运体的改变。结果发现,TRIM32敲除鼠的Syp、Syn1、GAP-43和PSD-95的蛋白及m RNA表达降低,免疫组织化学染色的结果也证实与此相一致。其次,我们也发现TRIM32 KO小鼠中与LTP密切相关的突触受体GABA_A表达显著降低,NMDA受体NR1、NR2A、NR2B亚基蛋白表达水平升高。虽然NR1的增加幅度不大,但NR2A和NR2B的增加幅度明显。免疫组化结果也发现TRIM32敲除小鼠中NR2A和NR2B蛋白表达上调。同样,PCR结果也证实了相应蛋白分子的m RNA水平的变化。Western blot结果还发现TRIM32敲除小鼠谷氨酸转运体EAAT2蛋白表达水平明显升高,GABA转运体SLC32A1表达水平明显降低。海马和皮层部分区域的EAAT2(红色)和SLC32A1(绿色)荧光双染证实了此结论。以上结果表明TRIM32基因敲除后,可影响参与学习记忆的神经递质及突触上关键分子的表达。4、脑电图的频率及幅度高低间接反应学习记忆情况。我们对TRIM32敲除小鼠的脑电活动进行了分析。对4000s的记录结果进行统计发现,与野生小鼠相比,TRIM32敲除小鼠放电幅度和频率明显升高,证实了TRIM32敲除小鼠神经电活动失衡。整体的LFP是突触活动的体现,滤波结果显示TRIM32敲除小鼠的LFP显著降低。在TRIM32敲除小鼠中,Delta波和Beta波的功率谱显著升高,而Theta波和Gamma波的功率谱显著降低。5、神经元是神经系统的结构和功能单位,我们通过Nissl染色观察神经元的完整性,发现敲除小鼠大脑皮层和海马区神经元数量都显著减少,也预示学习记忆及突触可塑性的减低。6、Notch信号通路可参与突触可塑性,我们体内外实验研究了TRIM32调控notch信号通路进而调节突触可塑性的机制。Western blots结果发现TRIM32敲除小鼠脑内notch相关基因(Notch1,Hes1,NGN3)表达明显高于同窝野生鼠。RT-PCR也证实了这些基因的m RNA表达水平的变化。同时,TRIM32敲除小鼠的NGF蛋白和m RNA表达水平也明显低于野生型小鼠。DAPT(γ分泌酶抑制剂),是众所周知的notch抑制剂。原代培养神经元上应用DAPT处理,发现notch1、hes1、ngn3 m RNA和蛋白表达呈现浓度依赖性下调。NGF在DAPT处理后保持不变(所有浓度)。Mash1也被发现以浓度依赖的方式上调。与此相一致的是,DAPT处理后神经元AMPA、NMDA(NR1、NR2A、NR2B)受体蛋白表达明显下调。GABA_A受体表达也轻度下调。同时我们还测定了它们对兴奋性(EAAT2)和抑制性(SLC32A1)转运蛋白的总体影响。DAPT处理后下调EAAT2和上调SLC32A1的表达。从而证实了我们的推论。结论:本研究表明,TRIM32的缺失会损伤突触可塑性,主要表现为LTP受损、树突棘数量减少、突触可塑性相关蛋白下调、兴奋和抑制的失衡导致神经元数量的减少。这些都是造成这种可塑性损伤的原因。脑电的变化也反映了TRIM32基因敲除突触可塑性的破坏。进一步研究结果表明,在TRIM32敲除小鼠脑内,notch及其相关分子的表达发生了改变,notch信号通路可能是TRIM32 KO小鼠突触可塑性受损的分子机制。综上所述:TRIM32可通过调控notch信号通路进而调节突触可塑性的变化。