肾细胞癌,即肾癌,是一种常见的泌尿系恶性肿瘤,其发病率居泌尿系肿瘤的前三位,恶性肿瘤的前十位。近几十年来,随着人们生活方式改变、环境污染、人口老龄化等因素的影响,肾癌的发病率在世界范围内都呈上升趋势。肾癌发病隐匿,早期患者多为无意体检时行影像学检查而发现,出现症状时多已处于疾病晚期。因肾癌对放疗和化疗天然抵抗,故对于进展期肾癌无可靠的治疗方案。近年来,虽然临床上已经开始应用多种肾癌分子靶向治疗方案,个别晚期肾癌患者获益明显,甚至能够处于长期无瘤的状态。然而分子靶向治疗价格昂贵,大部分患者仅能延长数月的生存期。鉴于基因层面对肿瘤的发生、演化、转移、耐药机制的影响及调控,肾癌的发生发展也是一个受多种基因多步骤调控的复杂过程。因此,深入研究和探讨与肾癌发生发展密切相关的基因,对加强和促进肾癌的防治工作具有重要意义。细胞周期是细胞发生DNA复制和分离的一系列重要事件的过程。存在很多不同的机制调控细胞周期保证细胞周期顺利并精确的进行。有丝分裂是细胞周期中一段重要的时期,现已成为细胞生理学和肿瘤研究中的活跃主题。在有丝分裂过程中,母细胞DNA等细胞成分进行复制,并准确分裂成含相同遗传物质的两个子细胞。在有丝分裂过程中,细胞内进行了一系列宏伟壮观的变化,如核膜破裂、着丝粒纺锤体聚集、染色体集合、染色体分离等。在有丝分裂过程中,细胞内形成双极纺锤体,并通过微管和着丝粒粘附在染色体上进行牵拉,保证了在有丝分裂中染色体分离到两个子细胞中。在此过程中的任何偏差将会干扰染色体的正确分离,并会导致染色体不稳定性(chromosome instability, CIN)或异倍体形成,而CIN和异倍体细胞则是固体肿瘤的一个特征。现有的证据表明CIN不仅只是肿瘤的一种特征表现,也是肿瘤随后发展的原因。着丝粒复合体作为有丝分裂过程中形成的重要细胞结构成分,其参与和调控细胞有丝分裂,使其正常精细的进行,着丝粒蛋白功能失调会导致CIN和异倍体细胞的形成。着丝粒蛋白是一个装配在染色体DNA上的一个大型多蛋白复合体。它给纺锤丝牵拉染色体提供附着点。现已有百种以上着丝粒蛋白家族成员被相继发现。它们在肿瘤发生发展中的作用也愈受重视。一些着丝粒蛋白家族的常见成员,如CENPA、CENPF、CENPH和INCENP等被发现和多种肿瘤的病理生理过程密切相关。尽管它们在肾癌中也表现出表达的异常,但其在肾癌中的作用我们得知尚少。着丝粒蛋白H (centromere protein H, CENPH)作为着丝粒蛋白家族的重要一员,是活性着丝粒复合体的重要组成成分,对细胞有丝分裂的准确进行有重要的调控作用。近年来着丝粒蛋白家族在肿瘤发生发展中的作用愈受重视,研究显示CENPH在多种恶性肿瘤表达异常增高,且和患者的预后相关,但由于肿瘤的异质性,CENPH在肾癌中是否发挥核心调控作用,尚不得为知。本论文旨在研究CENPH对肾癌发生发展的影响探讨其可能的影响机制。本项研究分为三大部分。第一部分通过分析团队前期进行的肾癌转录组测序项目的肾癌与癌旁组织的差异表达基因数据,分析包括CENPH在内的多种着丝粒蛋白家族成员在肾癌组织中的表达情况。第二部分用qRT-PCR和免疫组织化学技术对CENPH在肾癌中的表达情况进行验证,并进一步研究其与肾癌临床病理学特征之间的关系,探讨其作为肾癌诊断及预后指标的可能性。第三部分通过检测CENPH在四种肾癌细胞株中的表达情况,建立肾癌CENPH沉默干扰模型,研究CENPH对肾癌细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响,并探讨其可能的作用机制。第一部分肾癌转录组测序揭示着丝粒蛋白H在肾癌组织中高表达目的：1.转录组测序揭示肾癌组织与癌旁正常肾组织的基因表达差异谱2.分析着丝粒蛋白家族成员在肾癌组织与癌旁正常组织表达的差异性3.分析CENPH在肾癌及其他肿瘤组织中的表达情况材料与方法：1.使用Illumina HiSeqTM 2000测序平台对34对肾癌及癌旁正常组织进行转录组测序;2.对测序数据进行质控、比对、筛选,进行GO功能显著性富集分析和pathway显著性富集分析,找出差异基因表达谱；3.在已得到数据中分析着丝粒蛋白家族成员的表达差异情况；4.检索转录组数据及芯片数据,分析CENPH在肾癌中的表达特性。结果：1.转录组测序得出丰富的肾癌与癌旁组织基因表达差异谱通过以上34对肾癌及癌旁组织RNA-Seq测序,分析结果包括含20453个基因的mRNA相对表达量(未发表数据)。2.多种着丝粒蛋白家族成员在肾癌组织中高表达在测序结果中分析着丝粒蛋白家族的表达情况。最终测序结果包括20个着丝粒蛋白基因(CENPQ、CENPJ、CENPL、CENPV、CENPB、CENPI、CENPK、CENPE. CENPP、CENPW、CENPA、CENPN、INCENP、CENPT、CENPH、CENPO、CENPBD1、CENPM、 CENPF、CENPC1)的表达情况。多数基因在肾癌组织中呈高表达,其中以CENPH高表最为明显。3. CENPH在包括肾癌在内的多种肿瘤组织中表达增高CENPH在所有的34对肾癌配对样本中表现为高表达,检索GENT芯片数据库显示CENPH在包括肾癌在内的多种恶性肿瘤中表达上调。结论：转录组测序揭示多种着丝粒蛋白在肾癌组织中表达上调,其中以CENPH的高表最为明显,其表达异常可能与肾癌的发生发展有一定的联系。第二部分着丝粒蛋白H在肾癌组织中的表达特征及与患者预后的关系目的：1.检测肾癌组织中CENPH mRNA和蛋白的表达情况2.分析CENPH蛋白的表达水平与肾癌患者临床病理因素之间的关系3.分析CENPH蛋白的表达水平与肾癌患者预后的相关性,探讨CENPH作为肾癌分子标志物的可能性。材料与方法：1.用qRT-PCR方法检测21对肾癌组织和癌旁正常肾组织中CENPH mRNA的表达水平；2.通过免疫组织化学的方法在肾癌组织及癌旁正常肾组织石蜡包埋标本中检测CENPH蛋白的表达水平；3.使用SPSS 20软件,采用x2检验分析CENPH蛋白表达强弱与肾癌患者临床病理因素之间的关系；4.采用Kaplan-Meier法、Log-Rank检验和Cox比例风险模型分析CENPH蛋白表达水平对肾癌患者生存预后的影响。结果：1.肾癌组织中CENPH的表达显著高于癌旁正常肾组织在21个肾癌患者的癌组织及对应的癌旁正常肾皮质组织中检测CENPH mRNA的表达情况,qRT-PCR的检测结果和转录组测序结果相一致,显示CENPH在肾癌组织中高表达。2. CENPH蛋白的表达水平与肾癌患者的临床病理因素相关在109例肾癌标本中,79.8%(87/109)的肾癌组织为CENPH阳性表达,而在癌旁正常肾皮质组织中,仅22.0%(24/109)表现为CENPH阳性表达。CENPH主要定位于细胞核,部分患者胞浆也有轻微染色。进一步分析发现CENPH表达与患者的肿瘤Fuhrman分级(P=0.001)、远处转移(P=0.024)及临床分期(P=0.014)密切相关,未见其与患者性别、年龄、肿瘤大小和淋巴结转移相关。3. CENPH的表达水平与肾癌患者的生存预后相关在109例临床肾癌标本中,CENPH高表达的患者总生存时间较CENPH低表达的患者明显缩短(Log-Rank检验,P=0.002)。Cox回归模型分析表明,CENPH蛋白表达水平和临床分期是肾癌患者生存的独立预测因素。结论：1. CENPH在肾癌组织中高表达：2. CENPH有可能成为一种新的肾癌预后标志物。第三部分 着丝粒蛋白H对肾癌细胞生物学行为的影响及相关作用机制目的：1.研究CENPH表达水平对肾癌细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响2.探讨CENPH调节肾癌细胞增殖及凋亡的相关机制材料与方法：1.采用qRT-PCR和Western blotting方法检测四种肾癌细胞株和一种肾小管上皮细胞株中CENPH的表达情况；2.采用小干扰RNA转染技术建立CENPH沉默干扰的肾癌细胞株模型；3.通过CCK-8、平板克隆实验、流式Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测等实验观察CENPH对肾癌细胞增殖、凋亡等细胞生物学行为的影响；4.使用Western blotting检测肾癌细胞经CENPH siRNA转染后,相关增殖、凋亡标志蛋白的变化。结果：1. CENPH在肾癌细胞株中呈高表达我们检测四种肾癌细胞株和一种肾小管上皮细胞株中CENPH mRNA和蛋白的表达水平。和肾小管上皮细胞株HK-2相比,三种肾癌细胞株(ACHN,786-0和A704)中CENPH高表达(P<0.05),而仅在细胞株A498中未见CENPH高表达。2.下调肾癌细胞中CENPH的表达水平导致细胞增殖能力的降低在相对高表达CENPH的肾癌细胞株ACHN和786-0中转入CENPH siRNA干扰沉默CENPH,建立CENPH低表肾癌细胞模型,检测细胞体外生长活力、克隆形成能力,发现干扰沉默CENPH能降低肾癌细胞的体外增殖能力。3. CENPH调节肾癌细胞的凋亡肾癌细胞株ACHN和786-0分别转染CENPH siRNA降低CENPH的表达,两天后使用annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。流式细胞学结果显示降低表达CENPH能增加肾癌细胞的凋亡水平。4. CENPH影响Ki-67和Survivin的表达使用Western blotting方法检测增殖和凋亡的分子标志物,发现转染si-CENPH可抑制肾癌细胞中增殖蛋白Ki-67和细胞凋亡抑制蛋白Survivin的表达。结论：1. CENPH在多数肾癌细胞株中高表达；2.敲低肾癌细胞中的CENPH表达可以抑制细胞增殖活力,增加细胞凋亡的比例：3. CENPH对肾癌细胞生物学行为的影响可能是通过影响Survivin蛋白的表达而发挥作用。现阶段,对肾癌分子标志物的基础研究有很多,尽管其中一些研究得出很好的结论,但目前尚无可靠的分子标志物可以真正用于临床上的肾癌患者。所以设计严密并就有可重复性的基础和临床研究显得非常重要。本研究针对肾癌这一放化疗不敏感,现有的分子靶向治疗疗效欠佳的临床棘手肿瘤,从调控细胞有丝分裂的着丝粒蛋白寻找研究切入点。用多种研究技术发现并验证CENPH在人类肾癌中高表达。其在肾癌组织中的表达和肿瘤的发生发展紧密关联。免疫组化实验显示CENPH高表达的患者较低表达的患者预后差。CENPH可以是肾癌患者的独立的预后标志物。我们也证明了CENPH siRNA的体外抑制肾癌细胞增殖、生长,并有诱导肿瘤细胞凋亡的能力。故CENPH也可能是肾癌治疗的潜在靶点。为了进一步验证CENPH在肾癌中的意义,我们需要进行大型多中心的肾癌患者的病例回顾研究。体外研究和更深层次的机制探讨也是我们接下来的任务。希望本研究能够对肾癌临床标志物、肾癌的诊断、预后判断及治疗研究提供一些新的基因切入点。