谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是放线菌的一类,被用来工业生产多种氨基酸。由于其简便的生物技术性能,谷氨酸棒杆菌也在大规模生产其他满足人们需要的细菌代谢产物上拥有巨大的潜能。谷氨酸棒杆菌作为工业重组蛋白的一大生产宿主菌,因具有生长迅速、被认为是安全生产的微生物等特点,在近年被人们进行了更加深入的研究。为了使谷氨酸棒杆菌更高效的生产重组蛋白,需要开发具有优良性能的“基因表达工具盒”,其包括:宿主、质粒、启动子、分泌途径以及其他一些与基因表达相关的元件。本文主要研究的是“基因表达工具盒”中的启动子。启动子是一个基因起始的信号或是一个基因簇指导RNA聚合酶合成RNA。启动子作为转录调控的重要元件,其活性的强弱在很大程度上影响着转录的起始、作用的时间以及外源基因在宿主细胞中表达程度,因此进而影响了外源基因在宿主细胞中的转录水平,最终影响着目标产物的高效表达。使用强启动子可以在一定程度上增加外源基因的表达,然而关于谷氨酸棒杆菌内源强启动子的报道十分少,本文旨在筛选鉴定出谷氨酸棒杆菌的内源强启动子,为构建谷氨酸棒杆菌细胞工厂提供有力元件。本实验室在前期工作中,对谷氨酸棒杆菌ATCC13032的细胞全蛋白进行了二维电泳,选取了一些高表达的蛋白点并对其进行分析,然后根据在线启动子预测网站进行启动子的分析和预测。本文从预测的70余个启动子中选取了 15个,通过与已知为谷氨酸棒杆菌强启动子的Ptac-M进行活性比较以鉴定出谷氨酸棒杆菌内源强启动子。本试验主要研究成果如下:(1)将这些启动子片段与实验室前期构建的启动子探测载体pDXW-11连接,成功构建相应重组启动子探测载体。(2)将重组质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)中积累重组质粒,并通过氯霉素进行筛选。通过筛选后所有启动子在含有氯霉素的LB培养基中均能正常生长,说明其在大肠杆菌中均具有一定的活性。(3)将验证成功的重组质粒转化进谷氨酸棒杆菌中,同样以氯霉素作为筛选条件。通过筛选后所有启动子在含有氯霉素的LBHI培养基中均能正常生长,说明其在谷氨酸棒杆菌中均具有一定的活性。(4)通过氯霉素梯度实验、酶活检测以及荧光定量PCR技术进一步检测启动子活性,并与强启动子Ptac-M进行比较。最终,本试验成功筛选了 P1937启动子,其可耐受40 μg/mL浓度的氯霉素,且氯霉素酰基转移酶酶活为对照启动子Ptac-M的11.2倍,荧光强度为Ptac-M的2.07倍。