论文部分内容阅读
Myf5是一类具有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构的转录调控因子.它在脊椎动物骨骼肌发育过程中起着重要调节作用.人们认为myf5基因在早期胚胎中的表达时相与其在决定肌肉发生过程中的作用是密切相关的.在爪蟾中,myf5基因转录起始于第10期胚胎背唇上方细胞中.随着原肠运动的进行,该基因的表达区域很快转移至赤道边缘带的背侧方细胞,然后向边缘带的腹侧方扩展.Nodal和Activin蛋白都是TGF-beta超家族的成员,而且它们都具有中胚层诱导功能.在爪蟾中已经证明Nodal采用和Activin相同或相似的信号传导机制.内源性的Nodal基因在爪蟾胚胎中首先表达在原肠期胚胎的背侧方细胞中,到了原肠运动晚期其表达区域也向边缘带的腹方延伸.这一表达时相强烈暗示我们Nodal信号可能参与了Xmyf5基因在原肠期胚胎赤道边缘带腹侧方转录的调控.所以,本文的工作着眼于研究负责爪蟾肌肉主控基因myf5在原肠期腹侧方细胞中表达的分子机制.首先,运用爪蟾动物极帽模型证明Nodal/Activin可以在动物极帽中诱导Xmyf5基因的表达.异位表达Xnrl mRNA于胚胎赤道边缘带腹侧方同样可以诱导Xmyf5基因表达.而且,这种异位表达可以被Xnrl的拮抗剂Cerberus-S所抑制.第二,根据Xmyf5上游启动子中一段指导基因在原肠期腹侧方表达的839bp序列设计四个系列缺失的质粒.使用这些质粒进行的荧光素酶测活实验以及转基因实验均表明:在Xmyf5启动子-4223位到-3798位的这段426 bp序列能够负责Xmyf5基因在胚胎原肠期腹侧方表达.第三,在426 bp序列中找到了两个Smad蛋白的结合位点(SBEs).凝胶阻滞实验证明Nodal信号通路中的Smad4蛋白能结合这两个SBEs.最后,通过PCR方法构建了一系列SBE位点突变的启动子.荧光素酶测活实验以及转基因实验结果证明:两个SBEs是负责Xmyf5基因响应Nodal/Activin信号并且指导报告基因在原肠期胚胎的赤道边缘带腹侧方表达所必须的调控元件.以上实验结果说明:Nodal/Activin信号能够介导Xmyf5基因在爪蟾胚胎原肠期赤道边缘带腹侧方细胞中的表达.