共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid, CLA)是亚油酸(Linoleic Acid, LA)衍生的共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。它具有多种营养和保健功能,如抗癌、抗动脉粥样化和延缓机体免疫力衰退、抑制脂肪积累等。由于利用微生物转化共轭亚油酸反应条件温和,产物异构体较单一,易于操作和控制,研究者对此进行了广泛的研究,发现亚油酸异构酶是生物转化共轭亚油酸的一个关键酶。随着研究成果的积累和分子生物学技术的应用,研究的热点由对共轭亚油酸异构酶的微生物来源、酶学性质的研究逐渐转向利用基因工程和生物信息学方法研究酶基因的克隆、表达以及表达产物的结构和性质。植物乳杆菌ZS2058(Lactobacillus plantarum ZS2058)是本实验室从泡菜中筛选到的一株具有产亚油酸异构酶的乳酸菌。根据NCBI中已报道亚油酸异构酶基因序列(DQ227322.1)信息,设计特异性引物,通过PCR扩增出亚油酸异构酶基因LAI。张白曦曾将LAI克隆至大肠杆菌表达载体pET28a,构建工程菌株pET28a/ E. coli BL21(DE3)和pET28a-LAI/ E .coli BL21(DE3)。本文对重组菌表达目的蛋白的条件进行了优化,确定最佳诱导条件为:IPTG浓度为0.1 mol/L,20℃下诱导20 h。利用his-tag标签,通过镍柱纯化可溶性的外源蛋白,当洗脱缓冲液中咪唑的浓度为200 mmol/L时得到单一的目的蛋白。气相色谱(GC)检测显示,重组亚油酸异构酶没有活性。接着将LAI基因克隆至酵母表达载体pKLAC1,构建重组表达载体pKLAC1-LAI,采用限制性内切酶SacⅡ进行单酶切,电转化乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis GG799),构建工程菌pKLAC1-LAI/K. lactis GG799。同时,用同样的方法构建阴性对照菌pKLAC1/K.lactis GG799。SDS-PAGE分析显示,LAI基因在乳酸克鲁维酵母中得到了分泌表达,确定较佳的发酵时间为4 d。气相色谱结果显示,重组菌培养液催化LA反应产物出现典型CLA峰型。若忽略产物提取过程中损失的LA,约有26%的LA被异构化为CLA。此外,还考察亚油酸异构酶基因在乳酸菌系统中的表达,选择的表达载体和宿主菌分别为pMG36e和乳酸乳球菌MG1363(Lactococcus lactis MG1363)。但在实验中发现重组质粒pMG36e-LAI不稳定,在大肠杆菌中经数次传代后质粒会消失,因此不适用于后续研究。通过对亚油酸异构酶基因在三种不同表达系统中研究,最终确定乳酸克鲁维酵母作本实验的宿主菌。亚油酸异构酶基因在乳酸克鲁维酵母中分泌表达的实现,避免了表达产物被细胞内蛋白酶降解,为进一步将亚油酸异构酶基因引入食品级微生物内生产CLA,从而开发保健功能性食品奠定了良好的理论和实验基础。