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目的:用聚合酶链反应(PCR)技术对HERG基因进行定点突变,为进一步深入研究抗心律失常药物对表达在HEK-293细胞中的HERG通道的作用位点奠定基础。
方法:(1)根据需研究的药物选择合适的突变位点,本研究中选用F656C,设计两对引物(包含预定的突变位点),通过三轮PCR扩增,扩增出所含突变位点的片段,通过酶切连接的方法将突变位点引入到以pcDNA3为载体的HERG质粒中;(2)将野生型和含有突变位点的HERG基因质粒分别转染到HEK-293细胞;(3)采用全细胞膜片钳技术分别记录其电生理电流。
结果:(1)选择了多数Ⅲ类抗心律失常药物的作用位点F656作为突变位点,以野生型HERG基因为基础获得了HERG cDNA F656C的突变基因,酶切鉴定结果符合预期,测序表明在所送检的序列中发生了预期的突变;(2)成功记录了转染在HEK-293细胞中的野生型HERG和突变型HERG的电生理电流,具有典型的HERG通道特点。
结论:证实获得了F656C突变型HERG基因,成功将其转染至HEK-293细胞中并记录到其电生理电流,为进一步研究对HERG通道有作用药物的作用发生位点铺平了道路。