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如何充分利用生物固氮资源为农业生产服务是一个重要的研究课题。论文以采集于华南农业大学野生稻核心收集圃(Wild Rice Core Collection Nursery of South China Agricdtural University)的高秆野生稻(Oryza alta)和宽叶野生稻(O.latifolia)为研究材料,采用平板划线法和显微镜检测分离纯化其内生菌。经乙炔还原法测定固氮酶活性、固氮酶nifH基因扩增、生理生化测定(唯一碳源利用、API 20E、抗生素抗性、NaCI耐受性、pH范围)、全细胞蛋白电泳、插入序列指纹图谱、脂肪酸成分分析、总DNAG+Cmol％测定、DNA-DNA杂交、显微电镜观察及系统发育分析,确定了水稻根瘤菌新种(Rhizobium oryzae sp.nov.)和水稻肠杆菌新种(Enterobactel oryzae sp.nov.)两个固氮菌新种。选取了水稻肠杆菌新种的代表性菌株,进行GFP荧光标记,接种水稻,证明为内生固氮菌。同时选取固氮酶活性高的菌株接种水稻,进行盆栽和田间试验,均表明能明显促进水稻生长。
高秆野生稻和宽叶野生稻中内生固氮菌具有多样性。采用YMA和NFb培养基从高秆野生稻中分离到23株固氮菌;利用VM培养基,从宽叶野生稻中分离到12株内生菌。16S rRNA基因序列测定结果表明,从高秆野生稻分离的内生固氮菌分别属于α-变形菌纲的根瘤菌属(Rhizobium)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)和β-变形菌纲的艾德昂菌属(Ideonella);从宽叶野生稻分离的内生固氮菌分别属于假单胞菌属(Pseudomonas)、泛菌属(Pantoea)、固氮螺菌属(Azospirillum)、肠杆菌属(Enterobacter)。除根瘤菌属菌株以外,这些菌株在培养基上都有固氮酶活性,但固氮酶活性差异较大。
经多相分类方法鉴定结果表明,从高秆野生稻(Oryza alta)中分离的类群Ⅰ菌株为根瘤菌的一个新类群(代表菌 Alt505T),经鉴定命名为水稻根瘤菌新种(Rhizobiumoryzae sp.nov.)。该新种为革兰氏阴性细菌,杆状、能运动、端生鞭毛、不形成芽孢、细胞大小0.8-1.0×1.4-1.8μm(宽×长)。兼性厌氧、化能营养型。菌落在YMA培养基上呈圆锥形、乳白色、半透明、280℃培养3天,可以长到3mm的菌落。生长温度10-40℃(最佳生长温度28-37℃)、pH生长范围5.0-8.0,最佳生长pH值6.0-7.0。高于1.5％的NaCl抑制菌株生长;模式菌株Alt505T(=LMG 24253T=CGMCC 1.7048T)的G+Cmol％为64.1±O.4mol％。
从宽叶野生稻(Oryza latifolia)中分离的以Ola 51为代表的新类群A是一种完全不同于阴沟肠杆菌的细菌,命名为水稻肠杆菌新种(Enterobacter oryzae sp.nov.)。革兰氏阴性细菌,杆状或轻微弯曲、能运动、端生鞭毛、大小0.8-1.1μmx1.5-2.0μm(宽x长)。兼性厌氧、化能营养型、具固氮能力。菌落在VM培养基上呈圆锥形、透明。生长温度10-40℃(最佳生长温度28-37℃)、高于5％的NaCl抑制其生长、pH生长范围3.5-10.0。模式菌株Ola 51T(=LMG 24251T=CGMCC 1.7012T)的G+C mol％为55±0.4mol％。