【研究目的】研究C6脑胶质瘤诱导的不同区域BBB通透性的改变,及不同剂量单次全脑放射线照射后早期大鼠BBB通透性的动态变化,从微血管超微结构特征和紧密连接蛋白Claudin-5探讨BBB/BBTB通透性增高的主要途径及其开放的变化情况,研究和探讨放疗与血脑屏障开放规律的关系,为指导脑胶质瘤放疗提供动物实验依据和可能的适时介入化疗的剂量域及时间域。【材料方法】(1)采用立体定向方法在大鼠右侧尾状核接种10μl含1×106胶质瘤细胞,建立大鼠C6胶质瘤模型20只。观察大鼠的生存状态、记录生存时间,接种后第10、14、20天分别行MRI增强扫描。评价此方法胶质瘤模型成瘤率、瘤体大小变化情况、瘤生长持续时间,为后续研究提供稳定的胶质瘤模型来源。(2)空白组和荷瘤组大鼠各5只,荷瘤鼠于建模后第20天取肿瘤处、肿瘤临近处(brain adjacent to tumor,BAT)即距肿瘤边界2mm以内及肿瘤远隔处(brain distant to tumor,BDT)即2mm以外的大脑半球脑皮质3个部位的脑组织和空白鼠右侧尾状核正常脑组织,采用外源性硝酸镧透射电镜示踪法,观察BBB/ BBTB超微结构特征及硝酸镧渗出情况,判定BBB破坏程度。(3)空白组和荷瘤组(建模后20天)大鼠各5只,经免疫组化法测定紧密连接蛋白claudin-5在空白鼠和荷瘤鼠上述各部位的表达情况。(4)荷瘤鼠(建模后17天)120只,随机分为5组,即假照射组、5Gy、10Gy、15Gy、20Gy组,行相应剂量全脑放射线单次照射。其中假照射组(来源于第一、二部分试验),5Gy、10Gy和20Gy组各20只,于照射后1d处死8只,各4只分别行硝酸镧透射电镜示踪法观察BAT处BBB/BBTB通透性及免疫组化法测定紧密连接蛋白claudin -5的变化研究;15Gy组60只,分别于照射后1d、3d、7d、14d、21d、28d各处死8只进行上述相关指标的检测;每组剩余12只至自然死亡。观察并记录各照射组大鼠的生存状态、生存时间。【结果】(1)SD大鼠右侧尾状核立体定向方法建立的C6脑胶质瘤模型确切可靠,成瘤率达97%以上,未见远处及颅外转移。荷瘤大鼠的早期症状包括运动减少,攻击性减弱和精神萎靡等,晚期则有偏瘫、眶周出血、癫痫和恶液质等表现,大鼠体重进行性减轻。MRI检查见肿瘤呈圆形或类圆形,呈长T1低信号和长T2高信号,大多呈环状强化。(2)硝酸镧示踪电镜观察C6胶质瘤荷瘤鼠:肿瘤处可见La3+通过血管内皮细胞的紧密连接及基底膜广泛渗透至血管腔外及脑组织间隙内,部分毛细血管内皮细胞及神经细胞失去正常形态,结构破坏,大量La3+沉积在细胞核内、外;BAT处见La3+渗出至局部BM,大部分停滞在血管腔内,未见La3+渗透至血管外脑组织间隙内;BDT及对照组NBT处La3+分布在血管腔内,血管内皮细胞TJ结构完整,基底膜呈线状连续,脑血管内皮细胞浆均未见La3+,血管腔外未见镧颗粒沉积。统计学分析硝酸镧渗出显示:肿瘤处>BAT >BDT、NBT(P<0.05),而BDT、NBT两组结果无统计学差异。(3)硝酸镧示踪电镜观察各不同剂量照射组荷瘤鼠BAT处BBB通透性:5Gy组荷瘤鼠BAT处见La3+渗出至局部基底膜,大部分分布在血管腔内,细胞形态结构未见明显异常;10Gy组BAT处可见La3+渗出至广泛基底膜,渗出量增加,紧密连接开放,细小的高电子密度镧颗粒渗出至脑组织间隙,内皮细胞肿胀,部分滞留在血管腔内;15Gy、20Gy组BAT处均可见La3+渗出至基底膜、血管腔外、脑组织间隙内及细胞内,内皮细胞肿大,脑组织水肿。统计学分析硝酸镧渗出显示:20Gy、15Gy>10Gy>5Gy、0Gy(P<0.05),而0Gy、5Gy两组间及15Gy、20Gy两组间结果无统计学差异。(4)硝酸镧示踪电镜观察15Gy组照射后不同时间点荷瘤鼠BAT处BBB通透性变化:照射后第1、3天La3+渗出至基底膜、血管腔外、脑组织间隙内及细胞内,少许残留在血管腔内;第7天为La3+渗出至基底膜,脑组织间隙内见细小的镧颗粒,但细胞内未见渗出,较前减弱;第14天为La3+渗出至局部基底膜,血管腔外、脑组织间隙内及细胞内均未见镧颗粒沉积,大部分滞留在血管腔内;第21、28天均为La3+仅分布在血管腔内,未见渗出至基底膜、血管腔外及脑间质裂隙内。统计学分析硝酸镧渗出显示:1d、3d>7d>14d>21d、28d(P<0.05),而1d、3d两组结果无统计学差异,21d、28d两组结果完全相同。(5)紧密连接蛋白claudin-5在空白鼠和荷瘤鼠脑组织中均沿血管内皮细胞浆呈棕黄色或棕褐色阳性表达。对照组脑组织claudin-5的表达丰富、连续,呈中-强度表达,沿血管内皮细胞胞浆见棕黄色强染色;荷瘤组大鼠肿瘤处claudin -5表达减弱,呈轻度表达,沿血管呈间断表达;BAT较对照组脑组织表达下降,呈中度表达,血管扭曲、变形,但仍呈连续状态;BDT与对照组正常脑组织claudin-5表达相仿。统计学分析claudin-5表达显示:肿瘤处>BAT>BDT、NBT(P<0.05),而BDT、NBT两组结果无统计学差异。(6)紧密连接蛋白claudin-5在各不同剂量照射组荷瘤鼠BAT处的表达变化:5Gy组荷瘤鼠BAT处见较对照组脑组织表达下降,仍呈中度表达,血管扭曲、变形,但仍呈连续状态;10Gy组BAT处可见较对照组脑组织表达下降,呈轻中度表达,血管扭曲、变形与间断表达状态并存;15Gy、20Gy组BAT处均可见较对照组脑组织表达下降,呈轻度表达,沿血管间断表达,并见碎片状。统计学分析:20Gy、15Gy>10Gy>5Gy、0Gy(P<0.05),而0Gy、5Gy两组间与15Gy、20Gy两组间结果无统计学差异。(7)紧密连接蛋白claudin-5在15Gy组照射后不同时间点荷瘤鼠BAT处的表达变化:照射后1d、3d紧密连接蛋白claudin-5呈轻度表达,沿血管间断表达,并呈碎片状表达;照射后第7d为轻中度表达,血管扭曲、变形与间断表达状态并存;照射后第14d为中度表达,血管扭曲、变形,但仍呈连续状态;照射后第21d、28天为中强度表达,出现部分小血管闭塞,出现连续与碎片表达并存。统计学分析:1d、3d>7d>14d>21d、28d(P<0.05),而1d、3d两组间与21d、28d两组间结果无统计学差异。(8)C6胶质瘤肿瘤组织、BAT、NBT三个区域的硝酸镧渗出与claudin-5表达两者之间呈负相关,相关系数为rs=-0.599,P=0.04。肿瘤BAT处不同剂量放疗1d后及15Gy照射后不同时间点的硝酸镧渗出程度与claudin-5表达均呈显著负相关,相关系数分别为rs=-0.678,P=0.001和rs=-0.571,P=0.004。(9)各组大鼠的生存时间:假照射组、5Gy组、10Gy组、15Gy组、20Gy组的MeST分别为24d、30.5d、37.5d、49d、63d,各组的MST分别为24.3±3.7d、33.0±7.4d、39.8±10.0d、65.3±47.1d、84.4±58.8d;四个照射组MeST的%ILS分别为27.1%、56.3%、104.2%、162.5%,各组MST的%ILS分别为35.8%、63.8%、168.7%、247.2%。四个照射组的生存期与假照射组比较均具有统计学差异(P<0.05)。【结论】(1)大鼠C6胶质瘤模型建立成功,接种后颅内肿瘤呈浸润性生长,与人脑胶质瘤具有相似性。脑内接种1×106个C6细胞建立的模型用于治疗实验研究时,治疗处理时间以细胞接种后第2～3周为宜。(2)C6胶质瘤微血管超微结构改变是血脑屏障开放的结构基础,紧密连接开放是微血管通透性提高的主要原因。(3)C6胶质瘤不同区域内皮超微结构改变与屏障功能破坏程度不一,距离肿瘤处越近,硝酸镧渗出越明显,claudin-5表达越低,细胞间TJ破坏越重,与微血管通透性增加呈正相关;在BDT处似正常脑组织,血脑屏障稳定,硝酸镧不渗出,claudin-5表达丰富,通透性最低;肿瘤的周边存在不同程度的屏障,说明肿瘤存在周边屏障。(4)C6胶质瘤细胞的直接浸润可以降低内皮细胞紧密连接蛋白claudin-5的表达,claudin-5从细胞处丢失是TJ开放的分子基础,可能是诱导TJ破坏导致BBTB通透性增高的重要原因。(5)受照大鼠BBB均出现病理改变,放疗后大鼠claudin-5的表达进一步降低,说明放射线可致血脑屏障的紧密连接破坏增加,具有降低及破坏BBB功能的作用。(6)C6胶质瘤肿瘤组织、BAT、NBT三个区域的硝酸镧渗出与claudin-5表达两者之间呈显著负相关,荷瘤鼠不同剂量放疗后1d及15Gy照射后不同时间点的BAT处硝酸镧渗出程度与claudin-5表达均呈显著负相关。(7)荷瘤鼠全脑放疗期间随照射剂量和时间的变化,BBTB开放呈规律性变化:放射线损伤BBB的完整性发生在单次放疗剂量10～15Gy,且增加剂量BBB通透性无明显增加;单次放疗15Gy照射后2周BBB逐渐恢复,表现出剂量和时间依赖性。放射线具有治疗肿瘤作用,可延长生存期。