研究背景和目的炎症性疾病是一类由过度或持续的炎症反应导致组织损伤为特征的疾病总称,比如脓毒血症、心血管疾病、代谢性疾病、炎症性肠病等,涉及人体多个组织器官病变,这些疾病的共同特点表现为机体炎症反应调控的异常和免疫途径的失衡。Toll样受体（TLR）是一种重要的病原模式识别受体,在启动机体炎症反应和固有免疫中发挥着重要作用,其信号通路中关键蛋白的表达或调控异常均会导致机体免疫失调以及炎症反应的异常。尽管近年来的研究表明TLR信号途径参与了众多炎症性疾病的发生,然而对其信号途径的调控（即,哪些分子参与调控TLR信号转导）仍有待进一步研究。孤儿核受体Nur77（NR4A1、NGFI-B or TR3）是核受体NR4A超家族中的一员,在机体生理和病理状态中均发挥着重要的作用。Nur77作为一种立早基因,可被脂多糖（LPS）、白介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、等多种细胞因子、炎症介质诱导表达。Nur77通常定位于细胞核,可通过其经典的基因型效应转录调控多个靶基因的表达,例如,BRE、CCND2、E2F1等,参与细胞的生存、增殖、凋亡等多个生物学过程;另一方面,Nur77还可从细胞核转位到细胞质,通过其“非基因型效应”参与调控细胞自噬、脂肪酸氧化以及肿瘤发生等多种生理病理过程。最近的研究表明,Nur77可通过其基因型效应调控炎症性疾病的发生。然而,Nur77是否还存在新型的非基因型调控机制介导炎症性反应,进而参与调控炎症性疾病的发生尚不清楚,有待进一步研究。在本研究中,我们旨在研究孤儿核受体Nur77在TLR信号起始的炎症性疾病中的作用;阐明Nur77通过与TLR信号转导的交互作用介导炎症性疾病发生发展的分子机制,以期明确Nur77/TLR信号转导新机制在炎症性疾病中的作用及临床意义。研究方法1.通过建立Nur77基因敲除小鼠炎症性疾病模型明确Nur77在炎症性疾病中的作用。2.HE染色和免疫组化分析炎症性疾病模型中小鼠组织器官损伤变化。3.Western blot检测组织细胞中相关蛋白的表达变化。4.RT-PCR检测组织细胞中炎症因子mRNA表达水平的变化。5.免疫共沉淀的方法研究蛋白之间的相互作用。6.荧光素酶报告系统检测Nur77对NF-κB转录活性的调控。7.免疫荧光和细胞核质蛋白分离方法检测蛋白在细胞中的定位情况。研究内容第一节Nur77在TLR起始的炎症性疾病小鼠模型中的作用通过使用Nur77基因敲除小鼠(Nur77^-/-)建立多种炎症性疾病模型,LPS诱导小鼠脓毒血症模型、LPS/D-GalN和Poly（I:C）/D-GalN诱导小鼠急性肝脏炎症模型和DSS诱导小鼠炎症性肠病（IBD）模型,研究发现与对照组小鼠(Nur77^+/+)相比,Nur77^-/-小鼠均表现出更加严重的炎症反应和组织器官的损伤。第二节孤儿核受体Nur77抑制了TLR起始的炎症反应Western blot检测LPS诱导的脓毒血症模型小鼠肝脏、脾组织和DSS诱导的IBD模型小鼠结直肠组织中TLR信号通路关键调控蛋白发现,与Nur77^+/+相比,Nur77^-/-小鼠肝脏、脾以及结直肠组织中磷酸化IκBα（p-IκBα）蛋白水平明显升高;在细胞内过表达或敲低Nur77蛋白实验表明,过表达Nur77降低了细胞中IκBα蛋白磷酸化（p-IκBα）水平;反之,敲低Nur77升高了细胞中IκBα蛋白磷酸化（p-IκBα）水平;细胞核质分离实验表明,过表达Nur77通过对降低IκBα蛋白磷酸化（p-IκBα）水平减弱了p65的质核转移;荧光素酶报告基因和RT-PCR表明,Nur77通过影响p65的核质转移抑制了转录因子NF-κB活化下游基因的表达。第三节Nur77能够与TRAF6相互作用免疫共沉淀和免疫荧光实验均表明,内源性和外源性的Nur77和TRAF6都会发生相互作用,并且两者之间的相互作用会受到TLR信号的影响;通过对Nur77和TRAF6突变体结构的研究表明,Nur77是通过其N端结构域Nur77（1-267aa）与TRAF6的TRAF-N端结构域相结合;第四节Nur77抑制了TRAF6自身的泛素化和寡聚化细胞内免疫共沉淀分析Nur77和TRAF6相互作用结果表明,Nur77影响了TRAF6的自身泛素化水平;在LPS或DSS诱导TRAF6泛素化增强的小鼠体内及体外实验中,过表达Nur77抑制了TRAF6的自身泛素化水平;与之相反,敲低Nur77的表达升高了TRAF6的自身泛素化水平;Nur77突变体片段功能分析实验表明,Nur77抑制TRAF6的泛素化依赖于Nur77（1-267aa）N-端结构域;进一步的Nur77蛋白功能分析实验表明,Nur77是通过影响TRAF6的寡聚化进而抑制了TRAF6的泛素化。第五节Nur77抑制了TRAF6介导的NF-κB和AP-1的活化荧光素酶报告系统实验表明,细胞中过表达Nur77可以显著抑制TRAF6或LPS诱导激活的NF-κB和AP-1的荧光素酶活性,而且活性会随着Nur77过表达梯度的增加而呈现梯度的下降;反之,细胞中敲低Nur77会显著升高NF-κB和AP-1的荧光素酶活性;同样,在Nur77突变蛋白功能分析实验表明,Nur77抑制了NF-κB和AP-1的活化依赖于Nur77的N端结构域Nur77（1-267aa）。