结核病(TB)仍然是全球范围公共健康问题,主要由结核分枝杆菌(Mtb)感染引起,Mtb是一种胞内寄生菌,感染人体后主要居住在巨噬细胞内,巨噬细胞作为吞噬Mtb的主要细胞在感染Mtb的机体固有免疫应答中起主要作用,构成机体防御的第一道防线,该细胞主要通过吞噬、生成自由基及多种细胞因子、细胞凋亡、抗原提呈等多种途径杀灭Mtb。宿主抗Mtb感染的免疫机制复杂,众多免疫相关的介质参与其中,巨噬细胞是白三烯B4(LTB4)的主要来源之一,白三烯是花生四烯酸通过5-脂氧合酶途径代谢的产物,是有效的促炎脂质介质,研究表明LTB4具有多重功能,可导致白细胞趋化、粘附、脱颗粒、细胞因子分泌,可以影响多种生物效应,参与许多免疫性疾病的病理过程,如哮喘、类风湿性关节炎等,在疾病的病理过程中发挥重要作用。近年来LTB4在感染性疾病发挥的作用日益受到重视,包括寄生虫、细菌感染,但目前有关LTB4在结核感染中发挥的作用少有报道。本研究提出旨在探索如下问题:结核感染是否促进巨噬细胞表达LTB4,白三烯B4对巨噬细胞抗结核免疫中发挥的作用以及可能的机制,期望为临床抗结核病的辅助治疗提供实验依据。实验一:结核分枝杆菌及其抗原成份对巨噬细胞LTB4表达的影响目的:了解结核感染中引起巨噬细胞表达LTB4的成分。方法:采用不同剂量结核重组抗原Ag85B、ESAT-6和菌株H37Ra及BCG与巨噬细胞共培养4、24h,留取培养上清,ELISA检测LTB4表达量。结果:在共培养4h、24h时间段,巨噬细胞在结核及其抗原的刺激下均能生成LTB4,除H37Ra组外实验组与对照组比较均有统计学差异,且LTB4的量分别随Ag85B,ESAT-6量增多而增多,培养24h各组生成的白三烯B4量少于4h。结论:BCG和结核分支杆菌分泌蛋白ESAT-6、Ag85B促进巨噬细胞早期表达LTB4,而热灭活H37Ra不能促进巨噬细胞表达LTB4。实验二:LTB4对巨噬细胞抗结核免疫的作用目的:探索LTB4在巨噬细胞感染Mtb过程中发挥的作用。方法:采用改良抗酸染色方法确定THP-1吞噬现象,通过流式细胞术定量检测吞噬率;流式检测LTB4对感染细胞活性氧的影响;酸性磷酸酶染色确定LTB4对溶酶体影响;流式检测感染细胞凋亡率。结果:(1)比较加入LTB4后THP-1细胞对BCG的吞噬变化,在培养4h不同浓度外源性LTB4(1-100nM)都可以促进吞噬,吞噬率随剂量升高而升高,且这种作用可以被LTB4的BLT1受体阻滞剂U75302抑制,培养24h无促吞噬作用。(3)LTB4可以促进细胞活性氧的产生,并且可以提高感染细胞的活性氧。(4)LTB4促进感染细胞凋亡。结论:白三烯B4可以促进THP-1细胞吞噬Mtb,并通过产生活性氧和促进细胞凋亡来影响巨噬细胞抗结核免疫作用。实验三:探索LTB4对巨噬细胞抗结核免疫作用的机制目的:探索LTB4影响巨噬细胞抗结核免疫可能的机制。方法:巨噬细胞和结核共培养4、24h,施加不同的干预措施,采用qPCR和酶联免疫吸附试验测定感染结核的巨噬细胞TNF-α的mRNA及培养上清蛋白水平的表达,以及LTB4生成关键酶LTA4H的mRNA及LTB4表达水平。结果:感染4h、24h,外源性LTB4对感染结核巨噬细胞TNF-α表达水平均无影响,但促进其mRNA表达,4h后LTA4H生成抑制剂Bestatin下调TNF-α的mRNA水平,24h后LTB4受体抑制剂U75302下调TNF-α的mRNA水平。结论:外源性LTB4不影响TNF-α表达,但增高其mRNA水平,应用LTB4抑制剂可部分下调TNF-α的mRNA表达水平。