论文部分内容阅读
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种间质组织细胞,可以从不同的组织中分离得到如骨髓、骨骼肌、脂肪、脐带、循环系统、牙髓和羊水等,具有自我更新和多向分化的潜能,可诱导分化成骨、软骨、肌、脂肪和神经等多种细胞,在大鼠脑缺血区域或脊髓损伤区域移植MSCs能够促进其向损伤部位迁移并行使其修复功能。为了保证移植的MSCs由移植部位迁移到受损部位,且要保证迁移到损伤部位的细胞数量,这就需要研究调控细胞定向迁移的分子机制。研究发现HGF能够通过结合其受体c-met使β-catenin入核,从而激活Wnt/β-catenin信号通路促进细胞的迁移。而Dvl作为该信号通路的关键蛋白,参与调节HGF所诱导的肿瘤细胞的侵袭,本实验旨在研究Dvl对HGF诱导的MSCs定向迁移的作用机制。 采用全骨髓法从SD大鼠骨髓中成功分离并在体外培养出高纯度的MSCs。用P3代以上细胞作为实验材料,提取MSCs的总RNA,RT-PCR克隆得到SD大鼠的Dvl以及其结构缺失突变体△DIX和△DEP的cDNA,利用AdEasyTM系统构建重组腺病毒载体Ad-Dvl、Ad-ADIX和Ad-ADEP。构建成功的重组腺病毒在QBI-293A细胞中包装以及扩增,获得高滴度的病毒子,感染细胞以获得高表达Dvl、DIX和DEP的MSCs。同时针对SD大鼠Dvl基因由Abgent公司设计并合成FAM荧光标记的siRNA: FAM-siRNA,用脂质体转染MSCs降低Dvl的表达。为进一步检测Dvl在MSCs的定向迁移过程中的作用提供有利的工具。 首先研究Wnt/β-catenin信号通路对MSCs迁移行为的影响。通过使用抑制剂DKK1和FH535以及激活剂LiCl和Wnt3a改变Wnt/p-catenin信号通路,采用Boyden chamber与Dunn chamber装置研究表明激活剂LiCl和Wnt3a促进了MSCs迁移,而抑制剂FH535降低MSCs的迁移能力,并能够阻遏Wnt3a和LiCl对细胞迁移的促进作用。Western bolt表明Wnt3a和LiCl促进β-catenin的累积,而FH535能够抑制这一效应,说明激活的Wnt/β-catenin信号通路能够通过上调β-catenin调控MSCs迁移,但却发现抑制剂DKK1促进了MSCs的迁移,并略微增强Wnt3a促进的细胞迁移能力。据报道DKK1通过JNK调节细胞迁移,故此利用JNK的特异性抑制剂SP600125处理细胞,结果显示SP600125抑制DKK1对MSCs迁移的促进作用,同时发现DKK1能够增加.INK的磷酸化,这说明DKK1可能通过JNK介导的非经典Wnt信号通路调节MSCs的迁移。 为了证明Dvl在MSCs的定向迁移过程中的作用,利用实时荧光定量PCR从mRNA水平检测MSCs中Dvl三种亚型的相对表达情况,数据显示MSCs中Dv1的三种亚型均表达,但是相对表达量不同,Dv12表达量最高,Dvl1和Dvl3的表达量相对较低,仅仅占总Dv1表达量的10%。用Wnt3a, DKK1以及HGF处理后,Dvl三个亚型在mRNA水平上有较小的变化,这说明Wnt3a、DKK1以及HGF调节Dvl并不是在mRNA水平发挥作用的,可能是在蛋白水平或Dvl在胞内不同分布来发挥其生物学功能。 最后利用siRNA降低MSCs中Dv1的表达以及Ad-Dvl感染MSCs高表达Dvl,通过改变MSCs中Dvl的水平,利用Dunn chamber和Boyden chamber装置检测MSCs的迁移变化,结果显示siRNA抑制了MSCs的迁移,并减弱MSCs向Wnt3a以及HGF定向迁移的能力,而高表达Dv1能够促进MSCs的迁移,并增强Wnt3a以及HGF对细胞迁移的趋化作用。为了进一步阐明Dvl对MSCs定向迁移的作用,利用Ad-△DIX和Ad-ADEP感染MSCs数据显示Ad-△DIX能够抑制Wnt3a以及HGF诱导的MSCs的定向迁移,但Ad-△DEP没有显著变化。Western bolt检测结果表明Ad-Dvl、Ad-△DEP能够增加P-catenin的表达,Ad-△DIX没有此效果,这说明Dv1通过DIX结构域激活Wnt/β-catenin信号通路调节MSCs的定向迁移。但Ad-ADEP降低了DKK1促进MSCs迁移的能力,而且DEP结构域调节JNK磷酸化。 综上,Dvl通过上调β-catenin促进MSCs向Wnt3a以及HGF的定向迁移,当降低Dvl表达能够抑制Wnt3a以及HGF促进的MSCs定向迁移能力,而高表达Dvl通过激活Wnt/p-catenin信号通路增强Wnt3a以及HGF诱导的MSCs的定向迁移,在此过程中DIX结构域起着重要的作用。本实验为进一步揭示MSCs的迁移机制及临床应用MSCs进行干细胞移植提供了理论基础。