原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。目前对该病的发生机制、诊断和治疗的研究尚有许多局限之处。为更深入地探讨其发生机制、开展早期诊断并进行相关的基因治疗，郑州大学消化疾病研究所运用抑制性消减杂交的方法，建立了肝细胞癌消减cDNA文库并获得93个克隆，对这些克隆采用Northern杂交、RT-PCR方法作进一步的筛选和分析，结果发现差异表达基因的序列表达标签P02在肝细胞癌中高表达，通过在GenBank数据库中进行同源性分析，发现P02与翻译调控肿瘤蛋白高度同源，但其确切的功能尚需进一步研究。反义核酸技术是研究基因功能的有效手段。反义核酸技术是指在基因水平上设计具有封闭活性的基因片断，以达到选择性抑制特定基因复制、转录、或翻译的一种高生物技术，包括反义寡核苷酸、反义RNA及核酶三大技术领域，其中，反义寡核苷酸因具有更大的使用价值而倍受关注。反义寡核苷酸指合成的20个碱基左右的一小段核苷酸，按照碱基配对原则，与特定的靶序列杂交，从而抑制基因表达。具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点，已被越来越多的研究人员用于基因功能的测定。 目的 针对P02 mRNA的起始密码区设计反义寡核苷酸，用脂质体将其导入肝癌细胞系SMMC-7721，通过肝癌细胞生物学行为的改变来研究其功能，并为肝癌的基因治疗寻找新的靶点。 方法 实验分四组：反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、脂质体组、空白对照组。1．采用脂质体转染技术将5μg／mL的反义寡核苷酸导入肝癌细胞系SMMC-7721，用MTT法检测转染后24、48、72、96h的OD值，计算其生长抑制率。2．收集转染后72h的细胞，用70％乙醇固定，碘化丙啶染色，而后用流式细胞仪检测细胞周期各时相分布。3．收集转染后72h的细胞，抽提其总RNA，用逆转录PCR方法检测mRNA表达情况。郑州大学2000级硕上论文肝细胞癌高表达基因P02反义寡核普酸抑瘤作用的体外实验研究结果1.MTT结果显示:反义寡核昔酸能明显抑制肝癌细胞SMMC一7721生长，24、48、72、96h的细胞生长抑制率分别为53%、56%、85%、79%。而正义组、脂质体组则对细胞生长无抑制作用。 2.流式细胞仪检测细胞周期各时相分布结果显示，与空白对照组相比，经反义寡核昔酸处理的SMMC一7721细胞，细胞周期出现明显的抑制现象，G0/G;期细胞增多，S期及M期细胞明显减少，PI明显降低，而正义组及脂质体组则无明显变化。 3.逆转录PCR结果显示经反义寡核昔酸处理细胞后，与空白对照组相比，P02特异性扩增条带明显减弱，正义组、脂质体组P02特异性扩增条带则未见减弱。结论1 .P02基因在肝癌的发生发展过程中可能起着重要的作用，可望成为肝癌基因治疗新的靶点。.反义寡核昔酸技术是肝癌基因治疗的新手段。.采用计算机辅助设计反义寡核昔酸是设计反义分子的重要手段。