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目的:骨的生长代谢是由成骨细胞（成骨）和破骨细胞（吸收）共调控发挥作用,其中,成骨细胞在骨形成的过程中起着主导决定作用。力学环境是影响骨重建的重要因素,成骨细胞是骨响应力学刺激的重要效应细胞。力学刺激影响成骨细胞的增殖、分化和矿化等生物学过程,其加载强度、方式、持续时间等因素都可改变成骨细胞的生物学特性,进而影响成骨细胞的功能活性。各种高强度作业、体育运动以及灾害救援等非战争军事行动中,使得人们处于过载的力学环境中。目前,虽有相关研究探讨过载力学刺激对成骨细胞的影响,但其具体效应机理仍不明确。近年来,大量实验研究证明,中药淫羊藿苷能促进成骨细胞增殖、分化和矿化,一定药物浓度的淫羊藿苷对骨损伤修复起重要作用。本研究拟利用四点弯曲力学加载装置构建成骨细胞二维过载损伤模型,用于研究力学过载刺激对成骨细胞增殖、分化、凋亡和矿化等生物学特性的影响,探讨成骨细胞对过载力学刺激的响应机制;研究淫羊藿苷对过载成骨细胞的影响,揭示中药淫羊藿苷对过载骨损伤的预防及治疗机制。为研究过载力学刺激下骨损伤修复重建提供新的研究方法,进而为临床治疗提供理论依据。方法:1.分别选用药物浓度为0、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L的淫羊藿苷,对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞进行药物干预,然后采用MTT法评价成骨细胞增殖能力;HE染色观察细胞生长密度及形态变化;采用碱性磷酸酶试剂盒评价MC3T3-E1细胞早期分化能力;选用茜素红染色法评价MC3T3-E1细胞的矿化能力;最后,从不同药物浓度的各组中筛选出淫羊藿苷提高MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化能力的最适药物浓度。2.应用四点弯曲力学加载装置,构建两种过载损伤模型,施加的力学刺激参数分别为（频率为1.5Hz,强度为3000με的力学拉伸应变、每天6h连续三天和频率为0.5Hz,强度为5000με的力学拉伸应变、每天0.5h连续三天）,过载力学刺激后采用MTT法检测成骨细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,激光共聚焦显微镜评价细胞骨架,RT-PCR和Western Blot检测细胞分化标志基因表达情况,茜素红染色检测细胞矿化情况。3.选用最适药物浓度的淫羊藿苷分别在过载力学刺激加载前后加入培养的MC3T3-E1细胞中,加药结束后分别对成骨细胞的增殖、凋亡、分化和矿化等进行检测。4.采用RT-PCR和Western Blot方法检测淫羊藿苷对抗过载力学刺激对经典Wnt/β-catenin信号通路中各个分子表达的影响;采用免疫荧光的方法检测淫羊藿苷对抗过载力学刺激对β-catenin蛋白的活化以及其向细胞核转移的影响。结果:1.一定浓度区间的淫羊藿苷能促进成骨细胞的增殖,其中,药物浓度为10-7mol/L的淫羊藿苷显著促进成骨细胞增殖。HE染色提示,成骨细胞一般呈不规则形态分布,如三角形、长梭形、多角形等形态,其中,药物浓度为10-7mol/L实验组的成骨细胞数目最多,细胞密度最大。淫羊藿苷能显著提高成骨细胞碱性磷酸酶活性,其中,浓度为10-7mol/L组的成骨细胞碱性磷酸酶活性最高;10-4mol/L组的碱性磷酸酶活性最低;10-9mol/L实验组的碱性磷酸酶活性微高于空白对照组,但其差异不显著。一定浓度的淫羊藿苷能显著改善成骨细胞矿化能力,其中,浓度为10-7mol/L的淫羊藿苷明显提高了成骨细胞的矿化能力,其视野下可见大片钙结节积聚成团分布。2.与空白对照组比,力学过载组明显抑制成骨细胞的增殖活性;与对照组相比,力学过载组明显促进成骨细胞凋亡;激光共聚焦显微镜下观察,力学过载组的成骨细胞皱缩变形,微丝排列紊乱,骨架排列疏松,轮廓模糊,方向性差及骨架甚至出现破碎等现象,细胞核未见明显变化;RT-PCR和Western Blot结果表明,力学过载刺激抑制成骨细胞分化标志基因及蛋白的表达;茜素红染色结果表明,力学过载环境抑制成骨细胞钙结节形成。3.与力学过载组比,淫羊藿苷干预组明显促进成骨细胞的增殖活性,其中,预防给药组的增殖活性高于损伤后给药组;与力学过载组比,淫羊藿苷干预组的凋亡率低,其中,预防给药组的凋亡率最低;激光共聚焦显微镜下观察,预防给药组的成骨细胞大部分呈典型的三角形、长梭形、多角形等不规则形态分布,很难看见细胞皱缩变形,微丝排列紊乱等现象;RT-PCR和Western Blot结果表明,淫羊藿苷的干预能提高成骨细胞分化标志基因及蛋白的表达;茜素红染色结果表明,淫羊藿苷干预能有效提高成骨细胞钙结节形成。4.RT-PCR和Western Blot实验结果表明,力学过载刺激明显抑制Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin和Runx2基因及蛋白的表达,药物淫羊藿苷的干预可提高力学过载损伤后β-catenin和Runx2基因及蛋白的表达,其中预防给药组的β-catenin、Runx2基因及蛋白的表达高于损伤后给药;免疫荧光染色后在显微镜观察下,过载力学刺激明显抑制Wnt信号通路中β-catenin蛋白的表达,药物淫羊藿苷的干预可提高力学过载损伤后β-catenin蛋白的表达,其中预防给药组中的β-catenin蛋白的表达高于损伤后给药。结论:1.一定药物浓度的淫羊藿苷能促进成骨细胞的增殖、分化及矿化,其最适药物浓度为10-7mol/L。2.过载力学刺激明显抑制成骨细胞的增殖、分化及矿化。3.淫羊藿苷可以在一定程度上修复力学过载导致的成骨细胞损伤,其中预防给药的效果明显优于损伤后给药。4.药物淫羊藿苷对抗过载力学刺激是通过影响经典Wnt/β-catenin信号通路,上调了Runx2蛋白的表达,进而促进成骨细胞的增殖、分化及矿化。