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牛乳富含多种营养物质,因此是婴幼儿重要的食物来源。但据研究表明3%-6%的儿童对牛乳中的β-乳球蛋白(β-Lg)过敏,是亟待解决的的食品安全问题。本研究前期筛选出一株具有抗过敏性能的嗜酸乳杆菌KLDS 1.0738,并发现该菌株可逆转过敏炎症中的Treg/Th17失衡,但具体机制尚不清楚。新近研究提示一类非蛋白编码RNA-micro RNA(miRNA)是肠道黏膜免疫的重要调控因子,在炎症发生发展的Th细胞分化中发挥关键作用。但miRNA表达对牛乳过敏诱导的Th17失衡的调控作用尚未可知;益生菌与宿主肠道互作是否受特定miRNA调节也尚不明确。故本研究在以往工作基础上,通过构建细胞和动物模型,首先探明β-Lg诱发过敏细胞表达miRNA的作用,其次分析β-Lg过敏小鼠脏器中miRNA表达、Th17失衡和过敏炎症的相关性;进一步研究miRNA参与嗜酸乳杆菌抑制Th17细胞分化的作用。本研究从miRNA水平揭示益生菌缓解过敏的免疫机制,为寻找防治过敏的干预靶点提供重要线索。从细胞水平分析β-Lg诱发miRNA表达的作用。首先应用MTT试验分析β-Lg对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响。发现终浓度为0.1、0.5、1 mg/m L的β-Lg均可促进脾脏淋巴细胞体外增殖,且表现出剂量依赖关系。优选终浓度为1 mg/mL的β-Lg与脾脏淋巴细胞共孵育24 h,采用RT-PCR法检测miR-146a、miR-155、miR-21和miR-9的水平。结果显示,β-Lg可诱发淋巴细胞显著表达miR-155、miR-146a、miR-21和miR-9(P<0.05),特别是miR-155、miR-146a的表达分别是空白组的7倍和5倍。动物模型水平探讨miRNA和Th17细胞在β-Lg过敏中的作用。雌性KM小鼠随机分为空白组和β-Lg过敏组(n=6)。β-Lg过敏组小鼠每周1次给予腹腔注射1 mg/m L的过敏原(1m L弗氏佐剂+1 m L 1 mg/mLβ-Lg),共3周。试验的第21天,给予小鼠1 mg/mLβ-Lg口服激发后颈椎脱臼处死。RT-PCR法检测小鼠脾脏、结肠组织中miR-146a、miR-155、miR-21和miR-9的表达;RT-PCR法和酶联免疫吸附试验(ELISE)检测过敏小鼠血清和脾脏中Th17相关细胞因子和转录因子的表达。结果显示,β-Lg过敏组小鼠过敏症状显著,表现为过敏小鼠腹泻、平均体重减轻,结肠长度与重量均下降。病理学结果显示过敏小鼠结肠组织有明显炎性细胞浸润,且血液中嗜酸性粒细胞数目和血清中Ig E含量显著高于正常组(P<0.05),分别达到了(6.28±0.87)×109个/L和(134.78±9.51)ng/mL。与空白组相比,β-Lg过敏组小鼠血清Th17细胞因子IL-17、IL-6、TNF-α和IL-21的浓度显著升高(P<0.05)。与此相适应的是,过敏组小鼠脾脏中RORγt及IL-17 m RNA的表达水平也显著高于空白组(P<0.05)。各组小鼠脾脏和结肠组织中miRNA的表达结果显示,β-Lg过敏组小鼠miR-146a、miR-155、miR-21和miR-9的表达均显著高于空白组(P<0.05)。与细胞模型结果一致,β-Lg过敏原激可发小鼠高表达miR-146a和miR-155。进一步分析β-Lg过敏小鼠中Th17细胞和miRNA表达的相关性。结果显示,β-Lg过敏组小鼠脾脏组织中miR-21、miR-155、miR-146a及miR-9 mRNA的表达水平与IL-17 mRNA(r分别为0.997、0.996、0.998、0.995,P<0.05)和RORγt m RNA(r分别为0.983、0.974、0.983、0.983,P<0.05)均呈显著性正相关。细胞水平分析嗜酸乳杆菌对β-Lg过敏淋巴细胞表达miRNA的影响。试验结果显示,与Con A阳性对照组相比,嗜酸乳杆菌可抑制β-Lg过敏淋巴细胞过度增殖,特别是中、高浓度嗜酸乳杆菌抑制作用较高(P<0.05)。同时,嗜酸乳杆菌体外刺激β-Lg过敏脾脏淋巴细胞后可显著抑制miR-146a、miR-155、miR-21和miR-9的表达(P<0.05),且具有剂量依赖性。进一步应用不同浓度嗜酸乳杆菌(低浓度107 cfu/m L;中浓度108 cfu/mL;高浓度109cfu/mL)干预β-Lg过敏小鼠。结果显示,连续灌胃4周嗜酸乳杆菌后,过敏小鼠急性发作症状均有明显减轻;随着嗜酸乳杆菌浓度的增加,小鼠平均体重的净增长显著增加(分别为4.028±0.74 g;4.59±0.52 g;5.34±0.54 g);结肠的长度缩短现象有不同程度的缓解;炎性细胞浸润减轻,组织病理损伤评分明显降低;并且有效降低过敏小鼠血液嗜酸性粒细胞的数量及血清中抗体水平(P<0.05)。嗜酸乳杆菌干预可显著降低过敏小鼠血清中炎性细胞因子如IL-17、IL-6、TNF-α和IL-21的含量,抑制过敏小鼠脾脏组织中IL-17和RORγt mRNA的表达,并且高剂量嗜酸乳杆菌组的抑制效果显著优于低剂量组(P<0.05)。同时不同浓度嗜酸乳杆菌干预后能显著降低过敏小鼠结肠和脾脏组织中的miR-21、miR-155、miR-146a以及miR-9的表达(P<0.05),并具有剂量依赖性。综上结果,miRNA基因表达及IL-17和RORγt m RNA表达与β-Lg过敏症状严重程度密切相关,可以作为评价过敏反应的生物学指标之一。嗜酸乳杆菌缓解过敏的效果显著,推测可能与其调节miR-155、miR-146a和Th17的表达水平密切相关。