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背景与目的:原发性肝癌是世界最常见的消化道肿瘤之一,其恶性程度高、预后不佳。由于其低切除率、高复发率决定了化疗在目前肝癌综合治疗中占重要的地位,肿瘤多药耐药（multidrug-resistance, MDR）是临床肿瘤化疗的主要障碍,而肝癌细胞常对化疗药物产生原发性多药耐药,因此MDR也是肝癌患者化疗失败重要原因之一。MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时,对其他结构及作用机制不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药的现象。MDR的发生机制比较复杂,目前研究认为其主要涉及肿瘤细胞外膜上两类经典的转运蛋白。一类是ATP结合盒（ATP binding cassette, ABC）转运蛋白超家族,具有能量依赖的跨膜药物外输泵功能可以将细胞内底物包括多种抗肿瘤药物泵出肿瘤细胞外;另一类是溶质运载蛋白家族（solute carrier transporter superfamily）可调控细胞内抗肿瘤药物的吸收。两类转运蛋白的过度表达可介导肿瘤细胞耐药,若能克服肿瘤多药耐药问题,将使肿瘤化学疗效取得重大进展。线粒体对机体细胞有着重要作用,不仅具有产能、调控氧化还原、调节钙离子浓度、介导细胞内信号传递等作用,而且对于调节细胞凋亡和坏死起着关键性作用。而细胞凋亡又是化疗药物杀伤肿瘤细胞的共同通路。目前,线粒体介导的凋亡受到越来越多的重视,线粒体已成为筛选新型抗肿瘤药物的靶点之一。一方面,调控线粒体功能可以保护正常细胞,防止凋亡启动;另一方面,通过干扰线粒体功能,可促进一系列凋亡蛋白的释放,诱导肿瘤细胞发生凋亡。线粒体功能障碍和线粒体通透转运孔道（mitochondrial permeability transition pore, mPTP）状态密切相关,mPTP开放导致的线粒体通透转换（mitochondrial permeability transition, mPT）被认为是调控细胞死亡或生存,以及凋亡或坏死的重要环节。由于线粒体通透转运通道（mPTP）在细胞死亡有重要作用,mPTP开放能促进系列凋亡蛋白的释放从而诱导细胞凋亡,而肿瘤细胞凋亡逃逸或拮抗凋亡是其对化疗药物产生耐药的关键因素。研究mPTP与肿瘤多药耐药的关系,有助于进一步发现肿瘤多药耐药产生的细胞凋亡抑制机制,并为癌症治疗和多药耐药逆转提供新的作用位点和治疗途径。本研究首先建立稳定的人肝癌细胞SK-Hep-1的顺铂耐药细胞系,研究其生物学特性及耐药表型的变化,然后以人肝癌细胞株SK-Hep-1和建立的SK-Hep-1/CDDP耐药细胞为研究对象,通过调控mPTP功能状态,探讨调控mPT在肿瘤多药耐药过程中可能作用,期望为多药耐药逆转提供新的干预手段。研究方法:本研究分两部分:第一部分:体外培养人肝癌细胞SK-Hep-1,采用顺铂大剂量冲击,间歇诱导SK-Hep-1细胞耐药,极限稀释法克隆筛选,建立人肝癌顺铂（Cisplatin,CDDP）多药耐药细胞SK-Hep-1/CDDP;比较耐药细胞和亲本细胞形态、生长曲线、群体倍增时间的差异;CCK-8法检测耐药细胞和亲本细胞对不同浓度的抗肿瘤药物的药物敏感性,计算半数抑制率(IC50)和耐药指数（RI）;流式细胞仪检测SK-Hep-1/CDDP和SK-Hep-1的细胞周期和细胞的凋亡率;激光共聚焦观察P-gp （MDR1, ABCB1）和MRP1（ABCC1）在SK-Hep-1/CDDP和SK-Hep-1的表达定位;提取耐药细胞和亲本细胞的总蛋白,应用Western blot检测P-gp（MDR1, ABCB1）、MRP1（ABCC1）、Bax的表达。第二部分:采用mPTP开放剂苍术苷（ATR）和抑制剂环孢素A（CsA）分别干预SK-Hep-1和SK-Hep-1/CDDP细胞株,免疫印迹法检测P-gp（MDR1, ABCB1）、凋亡蛋白Bax表达水平;采用Annexin-V/PI双标记法检测细胞凋亡率;采用荧光探针JC-1检测线粒体膜电位的变化。研究结果:主要结果如下:1. SK-Hep-1/CDDP耐药细胞株形态基本接近亲本细胞。2.耐药细胞较亲本细胞生长缓慢,群体倍增时间延长,差异具有统计学意义（p <0.05）。3. CCK-8法测定SK-Hep-1细胞IC50为5.13±0.09μg/mL,SK-Hep-1/CDDP细胞IC50为70.61±1.06μg/mL,耐药指数为13.76,耐药细胞对阿霉素（DOX）、氟尿嘧啶（5-FU）等多种抗肿瘤药物交叉耐药。4.细胞周期分析发现相对于亲本SK-Hep-1细胞,SK-Hep-1/CDDP耐药细胞的G2/M,S期阻滞,G1期所占比例减少,两组相比差异均有统计学意义（p <0. 01）。5.共聚焦显微镜检测显示,SK-Hep-1/CDDP细胞中MDR1/P-gp、MRP1表达定位于细胞膜和细胞质。6. Western blot检测结果显示:与亲本细胞SK-Hep-1组相比,SK-Hep-1/CDDP细胞中MDR1、MRP1蛋白表达水平明显增加（p<0.01）,而Bax蛋白明显低于SK-Hep-1亲本细胞（p <0.01）。7. Annexin-V FITC/PI双标记结合流式细胞仪分析表明:耐药细胞SK-Hep-1/CDDP经CDDP处理后,凋亡细胞和坏死细胞的总和明显少于亲本细胞SK-Hep-1凋亡细胞和坏死细胞的总和。实验结果表明CDDP对耐药细胞的凋亡率明显减少。8.采用线粒体通透转运孔道开放剂ATR预处理细胞可促进mPTP开放,加速线粒体膜电位（ΔΨm）下降,同时降低Bax活性,增强顺铂诱导多药耐药细胞SK-Hep-1/CDDP凋亡作用（p <0.01）。9.采用线粒体通透转运孔道抑制剂环孢素A（CsA）预处理抑制mPTP开放,可减轻并延迟线粒体膜电位下降,使多药耐药细胞SK-Hep-1/CDDP对顺铂诱导凋亡的耐受能力提高,同时增加Bax活性（p <0.01）。结论:1.成功建立人肝癌多药耐药细胞株SK-Hep-1/CDDP。2. SK-Hep-1/CDDP其耐药机制可能与P-gp（MDR1）、MRP1的表达增加,Bax表达降低及降低化疗药物诱导肿瘤细胞的凋亡作用相关。3.促进mPTP的开放或能成为增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性及逆转肿瘤细胞多药耐药的新方法。