目的：我国肺癌的发病率和死亡率一直居于所有肿瘤类型的首位。其高病死率的主要原因在于肺癌具有较强的侵袭转移能力。肿瘤的生长增殖、侵袭转移有赖于肿瘤血管在其内的生成。因此，有效复制肿瘤在体内微环境中内部血管的生成过程及建立其技术模型对了解肿瘤血管生成机制有着极为重要的基础价值。液滴微流控芯片技术是近几年来发展起来的一项生物学技术手段，其将反应体系及细胞包裹在微小的独立液滴中，从而可以实现高通量、低消耗、无干扰的检测目标。本课题组将利用前期的液滴微流控技术工作基础，构建肺癌细胞三维培养液滴和血管内皮细胞二维培养液滴相联合的共培养液滴芯片平台，主要用于肺癌血管生成的形态及机制研究。同时，课题组前期工作中发现β-榄香烯联合放疗可以改变肺癌微环境，抑制肺癌微环境中血管内皮细胞的迁移、促进其凋亡。但是β-榄香烯对肺癌血管生成是否有作用及其可能的作用机制尚待确定，因此本课题将构建能模拟肿瘤血管微环境的液滴微流控芯片平台，并探讨β-榄香烯对肺癌血管生成可能的作用及机制。
　　方法：本课题将采取微流控芯片技术构建液滴细胞共培养模型，首先将肺癌细胞在液滴内实现三维培养，24h后在距离肿瘤细胞液滴0.15mm的距离处生成第二个液滴，将血管内皮细胞在其中进行二维贴壁培养，待内皮细胞液滴形成后用毛细管将两个液滴相连接，从而可以实现两种细胞的液滴共培养。其次，利用该液滴共培养模型，观察β-榄香烯作用于肺癌细胞A549后对血管内皮细胞的血管生成的影响。并且利用常规的小管形成实验来验证芯片平台的实验结果，同时利用划痕实验和Transwell迁移实验来观察β-榄香烯作用于肺癌细胞A549后其分泌液对血管内皮细胞迁移运动能力的影响。最后，利用Western Blot检测β-榄香烯作用下A549细胞的PFN2和Smad2分子表达情况、利用ELISA检测β-榄香烯作用下A549细胞分泌液中VEGFA的表达量，初步探讨β-榄香烯对肺癌血管生成可能的分子作用机制。
　　结果：本课题成功构建了不同细胞的液滴共培养模型。针对肿瘤细胞液滴利用冰冻切片免疫荧光染色观察缺氧诱导因子HIF-1α的表达，证实肿瘤细胞液滴内部存在缺氧状态，表明肿瘤细胞液滴可以更加真实的模拟体内肿瘤缺氧微环境。针对内皮细胞液滴在体式显微镜下直视可以明确观察到内皮细胞的小管形成情况，从而观察内皮细胞的血管形成能力。利用该液滴芯片共培养模型，在肿瘤液滴侧加入β-榄香烯，可观察到药物作用下血管内皮细胞的小管形成能力受到抑制。同时利用常规的小管形成实验证实了液滴芯片模型的结果，并且在划痕实验和Transwell迁移实验中也发现β-榄香烯作用下的A549细胞分泌液能使血管内皮细胞的迁移运动能力降低。最后，Western Blot结果表明β-榄香烯作用下肺癌A549细胞的PFN2和Smad2分子蛋白表达降低，ELISA结果证明β-榄香烯作用下肺癌细胞A549分泌液中的VEGFA减少。提示β-榄香烯可能通过影响A549的PFN2、Smad2和其分泌液中的VEGFA的分子表达来抑制内皮细胞的血管生成。
　　结论：本实验成功搭建了基于液滴微流控的液滴细胞共培养模型平台，通过该平台可以观察肿瘤细胞的三维生长及内皮细胞的成管过程，表明β-榄香烯能抑制肺癌的血管生成。同时用常规技术平台验证了共培养模型的实验结果，通过结合两种不同的技术手段较详实的证实了β-榄香烯对肺癌血管生成的抑制作用。并从分子水平上初步表明β-榄香烯是通过调节PFN2、Smad2和VEGFA的表达来发挥作用的。