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第一部分 GCN2改善小鼠脑出血后神经损伤的作用目的:在脑出血(intracerebralhemorrhage,ICH)模型中研究一般性调控阻遏蛋白激酶 2(general control non-derepressible-2,GCN2)和下游真核生物起始因子 2α(eukaryotic initiation factor 2 alpha,eIF2α)及其磷酸化、激活转录因子 4(activating Transcription Factor 4,ATF4)在ICH后动态变化和GCN2、eIF2α的细胞定位,观察外源性GCN2对改善小鼠短期行为学的影响,并选取最优治疗剂量,继而观察其对小鼠长期行为学的影响。方法:1、选取8周大小的成年雄性CD1小鼠,利用胶原酶制成ICH模型,随机分为以下6组,分别为:假手术组(sham)、ICH后3h组、6h组、12h组、24h组以及72h组(n=6)。采用western blot蛋白电泳方法测定基底节区脑组织GCN2蛋白和下游eIF2α表达水平及其磷酸化水平的表达,并采用免疫荧光检测的方法观察GCN2蛋白及eIF2α蛋白的细胞定位。2、通过脑水含量测定及改良加西亚(Garcia)评分评价sham组、ICH组以及以经鼻给药方式给予不同剂量外源性GCN2(低剂量组0.15μg/只、中剂量组0.5μg/只和高剂量组1.5μg/只)干预后的小鼠短期神经功能。3、采用水迷宫及转棒实验评价最佳剂量GCN2对ICH小鼠的长期神经功能的影响。结果:1、GCN2蛋白在ICH后3h开始升高,24h达到高峰,较sham组增加86%,72h下降,p-eIF2α在ICH后3h升高,6h达到高峰,表达水平较sham组增加1倍,72h仍持续高水平表达,eIF2α蛋白则无明显变化;2、GCN2及eIF2α蛋白在小胶质细胞、星形胶质细胞以及神经元细胞中均有表达,其中在小胶质细胞中表达较明显;3、中剂量外源性GCN2(0.5μg/只)在脑水肿含量测定和短期行为学中治疗效果优于其他组别,为治疗最佳剂量;4、ICH术后21天长期行为学,中剂量治疗组行为学检测结果好于对照组。结论:1、GCN2在ICH后随着时间增加而升高,到达高峰后下降,p-eIF2α短期内到达高峰并持续高表达,eIF2α变化不明显;2、GCN2以及eIF2α在小胶质细胞表达明显,同时在神经元细胞及星形胶质细胞中也有表达。3、GCN2对ICH术后小鼠的短期神经功能及长期神经功能具有保护作用。第二部分 GCN2对脑出血后抑制炎症作用机制的研究目的:通过特异性siRNA分别抑制eIF2α和ATF4,研究GCN2抑制ICH后炎症的作用机制。方法:选取30只8周大小的CD1雄性小鼠,随机分为6组(n=6):Sham组、ICH+溶剂组、ICH+GCN2 组、ICH+阴性对照 siRNA(CtrsiRNA)+GCN2 组、ICH+eIF2αsiRNA+GCN2 组、ICH+ATF4 siRNA+GCN2 组,Ctr siRNA,eIF2α siRNA 和 ATF4 siRNA(100pmol溶于2μl溶剂)以脑室内注射的方式在术前48小时注入假手术组和ICH手术组的小鼠脑内,外源性GCN2给药方式为经鼻给药。采用改良Garcia神经学评分,前肢位置测试以及转角实验测定24h神经功能,采用western blot检测GCN2、p-eIF2α、eIF2α、ATF4、NLRP3、IL-1β 及 TNF-α 的表达水平。结果:1、ICH后炎性指标NLRP3及TNF-α水平较对照组升高113%,IL-1β 水平较对照组上升52%;2、经外源性GCN2治疗后,炎性指标NLRP3水平较ICH组下降约31%,TNF-α水平较ICH组下降约28%,IL-1β水平较ICH组下降约57%;3、阻断eIF2α后,p-eIF2α表达较对照组下降约41%,低于sham组、eIF2α表达较对照组下降约27%,ATF4表达较对照组下降约55%,但GCN2表达不受影响;4、阻断ATF4后,ATF4表达较对照组下降约56%,但eIF2α、p-eIF2α和GCN2表达不受影响;5、相比较于对照组,p-eIF2α和ATF4被抑制后,同组标本的炎性指标NLRP3较对照组分别上升约67%和57%、IL-1β分别上升约1.2倍和1倍、TNF-α较对照组分别上升约27%和33%,表达水平接近于ICH组;6、阻断p-eIF2α或ATF4后,GCN2治疗组小鼠的Garcia评分、转角实验和前肢位置测试实验较对照组均下降明显。结论:1、脑出血后脑功能障碍与炎症反应有关;2、GCN2通过p-eIF2α/ATF4通路在ICH后起到抗炎以及改善短期神经功能的作用。