心血管疾病包括血脂异常、高血压、冠心病等,动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是这些心血管疾病的共同发病基础,主要累及大、中型动脉,其早期病变与巨噬细胞源性泡沫细胞密切相关,以脂质点及脂质条纹为病变特点。Ross认为动脉粥样硬化的各种改变,即从泡沫细胞、脂质条纹到纤维斑块、复杂斑块形成,是动脉慢性炎症的不同阶段。炎症损伤增加了内皮细胞的通透性及其对白细胞的黏附性,释放的趋化因子使单核细胞进入内膜转化为巨噬细胞,通过清道夫受体吞噬氧化低密度脂蛋白(O xidized low density lipoprotein, OxLDL)转变成泡沫细胞。这种巨噬细胞源性的泡沫细胞可增加脂质沉积,减少胆固醇的运出,促进脂肪条纹的形成,并成为AS继续发展的潜在位点。减少巨噬细胞源性的泡沫细胞,阻止脂质沉积,对于AS的防治有非常重要的作用。芹菜素主要来源于伞形植物旱芹叶,也存在于多种中药当中,属黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、神经保护、调节免疫等作用。我们在前期的动物实验中发现,芹菜素能减少载脂蛋白E敲除小鼠(ApoE-/-动脉粥样斑块的面积,并减少斑块内单核细胞/巨噬细胞抗原(Monocyte/Macrophage antibody, MOMA-2)的表达,提示芹菜素对动脉粥样硬化有一定的防治作用,这种作用可能与减少巨噬细胞源性泡沫细胞的数量有关。PI3K参与多种信号通路,激活后在质膜上产生第二信使PIP3,PIP3与细胞内含PH结构域的信号蛋白PKB结合,使Akt从细胞质转移到细胞膜,结合磷酯酰肌醇依赖激酶PDK1或PDK2,通过磷酸化Thr308和Ser473来活化Akt,最终参与调节细胞的增殖、分化、凋亡等活动。PI3K/PKB通路的活化是OxLDL抑制泡沫细胞凋亡的重要通路,有研究表明OxLDL可通过激活PI3K,增加糖摄取,增加巨噬细胞的存活。我们的结果显示,与native LDL相比,OxLDL刺激的巨噬细胞活力明显增高。同时,OxLDL的刺激增加了磷酸化Akt的表达,而芹菜素能抑制OxLDL导致的这些改变,并增加了巨噬细胞源性泡沫细胞的凋亡。我们通过双向电泳,检测了OxLDL刺激的巨噬细胞,在有或没有芹菜素预刺激之间的差异蛋白,经质谱鉴定,纤溶酶原激活物抑制剂-2(PAI-2)为差异蛋白之一。PAI-2属于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白,是尿激酶的抑制剂,主要存在于胎盘中,还普遍存在于单核/巨噬细胞、成纤维细胞和各种来源的成纤维细胞样细胞中,参与炎症、细胞增殖、肿瘤转移等生理病理活动,其具体机制尚未清楚。有研究表明,激活Akt磷酸化可增加PAI-2表达,为了研究两者之间是否存在关系,我们通过构建Akt过表达及Akt磷酸化ser473、thr308位点突变的慢病毒质粒,将质粒转染入小鼠腹腔巨噬细胞,观察转染后的PAI-2蛋白表达及对细胞活力的影响,并加入芹菜素和OxLDL刺激,研究芹菜素对巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡调控的机制。方法1.芹菜素对小鼠动脉粥样硬化的影响选用ApoE基因敲除小鼠,以高脂饲料喂养,随机分为3组(模型组,芹菜素组,辛伐他汀组),加上正常C57小鼠作为对照的正常组,共4组,每组6只,8周龄时,芹菜素组和辛伐他汀组以灌胃方式给药,喂养8周后,随机处死各组小鼠各1只,取主动脉进行病理形态学观察,以确定ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块形成后处死所有小鼠,取小鼠主动脉行苏丹Ⅲ染色及免疫组织化学技术检测,观察芹菜素对小鼠动脉粥样硬化斑块的影响及对斑块处MOMA-2抗原表达的影响。2.OxLDL对巨噬细胞的影响用腹腔灌洗法获得原代小鼠腹腔巨噬细胞,将细胞随机分为2组：OxLDL组,native LDL组；每组再分4小组：对照组(control),12.5μg/ml组,25μg/ml组,50μg/ml组,每小组3孔。继续培养96小时后,MTT法检测细胞活性。3.芹菜素对巨噬细胞源性泡沫细胞活力的影响用腹腔灌洗法获得原代小鼠腹腔巨噬细胞,将细胞随机分为4大组：24h,48h,72h,96h,每大组再分为3小组：对照组(control), OxLDL50μg/ml组,芹菜素50μmol加OxLDLml组,每组3孔。分别培养24小时,48小时,72小时,96小时,MTT法检测细胞活性。4.芹菜素对巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡的影响将细胞随机分2大组：DMSO (DMSO为芹菜素的溶剂)组和芹菜素组,每大组分为5小组：对照组(control), OxLDL12.5μg/nl组,OxLDL25μg/ml组,OxLDL50μg/inl组,OxLDL100μg/ml组。使用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒,按说明书操作,经FACSCalibur流式细胞仪检测,观察芹菜素对巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡的影响。5.双向电泳检测及质谱鉴定差异蛋白用腹腔灌洗法获得原代小鼠腹腔巨噬细胞,将细胞随机分为3组：对照组(control),OxLDL50μ g/ml组,芹菜素50μ M+OxLDL50μ g/ml (Api+OxLDL)组。提取细胞蛋白样品后,双向电泳参照IPGPhorⅢ等电聚焦系统程序指南和IPGstrip使用说明书进行操作,银染后所得凝胶经对比找出差异蛋白,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析,找出OxLDL、芹菜素对调控巨噬细胞凋亡可能起作用的蛋白。6. Western blot法分析芹菜素对磷酸化Akt. PAI-2蛋白表达的影响用腹腔灌洗法获得原代小鼠腹腔巨噬细胞,将细胞随机分为3组：对照组(control),OxLDL50μg/ml组,芹菜素50μM+OxLDL50μg/ml (Api+OxLDL)组。 Western blot的操作按本实验室常规步骤进行,在KODAK Image Station4000MM Digital Imaging System中曝光成像,用Image J图像分析软件分析目的条带的灰度值,检测芹菜素对p-Akt ser473、p-Akt thr308、PAI-2蛋白表达的调控。7.Rt-PCR法分析芹菜素对OxLDL刺激的巨噬细胞中PAI-2mRNA表达的调控。用腹腔灌洗法获得原代小鼠腹腔巨噬细胞,将细胞随机分为3组：对照组(control),OxLDL50μg/ml组,芹菜素50u M+OxLDL50μ g/ml (Api+OxLDL)组。按本实验室Rt-PCR常规操作步骤进行,反应结束后,利用仪器附带的软件获得标准曲线、熔链曲线及实验数据,分析芹菜素对OxLDL刺激的巨噬细胞中PAI-2mRNA表达的调控。8.分子克隆构建pcDNA3-flag/Akt质粒以pcDNA3-flag为载体,构建pcDNA3-flag/Akt质粒,用于后续Akt磷酸化位点突变及过表达Akt、磷酸化Akt ser473、thr308位点突变的慢病毒质粒构建。9.Akt磷酸化位点的点突变在pcDNA3-flag/Akt的基础上进行亚克隆,将Akt473位点上的丝氨酸变为甘氨酸,Akt308位点上的苏氨酸变为甘氨酸,构建出S473G、T308G、 S473G-T308G点突变质粒。10.构建Akt过表达、点突变慢病毒质粒以pHIV-H2BmRFP为载体,构建出pHIV-Akt过表达及pHIV-S473G、pHIV-T308G、pHIIV-S473G-T308G点突变慢病毒质粒。11.慢病毒包装及侵染小鼠腹腔巨噬细胞将构建的慢病毒质粒转染入293FT细胞72h后离心收集病毒上清,通过公式滴度(TU/ml)=表达GFP阳性细胞数×稀释倍数／病毒体积,计算病毒滴度,按MOI=50TU/Cell将对照病毒pHIV、过表达Akt慢病毒(Akt+)、点突变S473G、 T308G、S473G-T308G慢病毒侵染小鼠腹腔巨噬细胞,8h后换液。72h后观察侵染效率,Western blot法检测转染效应。12.Akt过表达或Akt磷酸化位点突变对巨噬细胞源性泡沫细胞活力的影响在前述转染有效的基础上,将每种转染不同慢病毒质粒的细胞随机分为3组：对照组(control),OxLDL50μg/ml组,芹菜素50μ M+OxLDL50μg/ml(Api+OxLDL)组。通过MTT法分析转染不同慢病毒质粒后对对巨噬细胞源性泡沫细胞活力的影响。13.Akt过表达或Akt磷酸化位点突变对PAI-2蛋白表达的影响在前述转染有效的基础上,通过western blot法分析转染不同慢病毒质粒后对PAI-2蛋白表达的影响,并加入芹菜素和OxLDL刺激,研究芹菜素对巨噬细胞源性泡沫细胞调控的机制。14.统计方法采用SPSS13.0统计软件进行分析,结果表示为：均数土标准差(x±S)。多组间比较单因素分析采用OneWay-ANOVA,多因素采用析因设计资料的方差分析,方差齐时,两组比较采用LSD,当方差不齐时,采用Welch稳健估计,再采用Dunnett’s T3方法两两比较。P<0.05表示有统计学意义。结果1.芹菜素对小鼠动脉粥样斑块面积大小的改变芹菜素组与辛伐他汀组的主动脉跟部AS斑块面积较模型组明显减小,与模型组比较差异有统计学意义(P0.000)。与辛伐他汀组比较,芹菜素组的斑块面积差异无统计学意义(P=0.397)。2.ApoE-/-小鼠主动脉斑块MOMA-2抗原表达芹菜素组与辛伐他汀组的斑块MOMA-2抗原表达明显减小,与模型组比较差异有统计学意义(P＝0.000),与辛伐他汀组比较,芹菜素组MOMA-2抗原的表达差异无统计学意义(P=0.764)。3.MTT法检测不同浓度OxLDL与native LDL对小鼠腹腔巨噬细胞活力的影响不同药物间细胞活力有显著差异(F=94.501, P=0.000),其中OxLDL组细胞活力(X=149.297%)显著高于native LDL组(X=117.771%)；不同浓度间细胞活力有显著差异(F＝77.191,P=0.000),脂蛋白50μ g/ml时细胞活力显著高于其他浓度的细胞活力,结合统计结果,OxLDL50μg/ml时细胞活力最大(206.024%)4.MTT比色法检测不同时间点,control组、OxLDL组、Api+OxLDL组细胞活性的变化不同时间点细胞活力有显著差异(F=525.521,P=0.000),24小时细胞活力最高(X=109.39%),随着时间递增,细胞活力降低,96小时最低(x=51.12%)；不同药物组间细胞活力有显著差异(F=1044.646, P=0.000), OxLDL50μg/ml组细胞活力最高(X=111.15%),芹菜素+OxLDL50μg/ml组最低(X=42.21%).5.流式细胞技术分析芹菜素对巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡的影响不同处理组间细胞凋亡率有显著差异(F=4688.481,P=0.000),芹菜素组细胞凋亡率(x=24.734%)显著高于DMSO组(X=7.87%)。6.双向电泳检测及质谱鉴定芹菜素干预巨噬细胞源性泡沫细胞的差异蛋白通过双向电泳及质谱鉴定蛋白,OxLDL组与芹菜素+OxLDL组(Api+OxLDL组)分别与control组对比,找出差异蛋白点22个。在OxLDL组有15个蛋白点相对于control组表达增高,其中6个蛋白点在有芹菜素预刺激的组(Api+OxLDL)中表达下调；在OxLDL组有7个蛋白点相对control组表达下调,其中4个下调蛋白点在Api+OxLDL组中表达升高。PAI-2蛋白为检测出的差异蛋白之一,它在OxLDL组中高表达,而在contro1组和Api+OxLDL组中低表达。7. Western blot分析P-Akt ser473. PAI-2蛋白在芹菜素干预的巨噬细胞源性泡沫细胞中的表达与control组相比, P-Akt ser473蛋白在OxLDL组显著增高,差异有统计学意义(P=0.000),PAI-2蛋白在OxLDL组显著增高,差异有统计学意义(P=0.006)；与OxLDL组相比,Api+OxLDL组的P-aktser473、PAI-2蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P-Akt ser473:P=0.000; PAI-2:P=0.000)。8.Rt-PCR法分析PAI-2mRNA在芹菜素干预的巨噬细胞源性泡沫细胞中的表达水平。通过荧光定量PCR技术检测小鼠腹腔巨噬细胞PAI-2mRNA表达水平的改变。结果显示：与cotrol组相比,OxLDL组PAI-2mRNA的表达显著增高,差异有统计学意义(’=0.023),与OxLDL组对比, Api+OxLDL组的表达显著降低(P=0.000)。9.慢病毒侵染小鼠腹腔巨噬细胞慢病毒载体pHIV-H2BmRFP带红色荧光蛋白,所构建的质粒转染入细胞后可表达红色荧光,将慢病毒质粒pHIV、Akt+、S473G, T308G、S473G-T308G侵染小鼠腹腔巨噬细胞后,经明暗视野对比,慢病毒转染效率高达约90%以上。Western blot法检测,p-Akt ser473蛋白的表达有显著差异(P=0.001),与pHIV组相比,Akt+组p-Akt ser473蛋白表达显著增高(P=0.015), S473G组与S473G-T308G组的表达显著降低,差异有统计学意义(S473G组P=0.012；S473G-T308G组P=0.013),而S473G与S473G-T308G组之间p-Akt ser473蛋白的表达无显著差异(P=0.954)；各组间p-Akt thr308蛋白表达有显著差异(P=0.002),与pHIV组相比,Akt+组、S473G组表达增高,差异有统计学意义(Akt+组P=0.042; S473G组P＝0.001)；T308G组、S473G-T308G组与pHIV组相比,均无显著差异(T308G组P=0.429；S473G-T308G组P=0.312),提示慢病毒转染有效。10. Western blot法检测慢病毒转染后PAI-2蛋白在小鼠腹腔巨噬细胞的表达感染不同慢病毒的各组间PAI-2蛋白的表达有显著差异(p＝0.001),与pHIV组相比,Akt+组的表达显著增高(P=0.001)。S473G组、T308G组、S473G-T308G组与pHIV组比较,PAI-2蛋白表达无明显差异(S473G组P=0.342; T308G组P=0.374；S473G-T308G组P=0.057)。11. MTT比色法测定慢病毒转染后细胞活力的改变不同药物组间细胞活力有显著差异(F=188.848, P=0.000), OxLDL组细胞活力最高(X=133.46%), Api+OxLDL组细胞活力最低(X=85.57%)；不同慢病毒感染的细胞活力有显著差异(P＝16.111,P=0.000),Akt+组细胞活力最高(x=117.36%)；在control组,Akt+组细胞活力显著高于pHIV组,差异有统计学意义(P=0.019)；在OxLDL组中,S473G组细胞活力显著低于pHIV组,差异有统计学意义(P=0.003)。12.Western blot法检测PAI-2蛋白在芹菜素干预的不同慢病毒侵染的巨噬细胞中的表达不同药物组间PAI-2蛋白的表达有显著差异(F=187.664,P=0.000),OxLDL组PAI-2蛋白表达最高(x=1.11),Api+OxLDL组最低(x=0.60)；转染不同的慢病毒,PAI-2蛋白的表达有显著差异(F=25.759,P=0.000),Akt+组表达最高(x=1.14)；在转染S473G组、S473G-T308G组中,加入OxLDL后PAI-2蛋白表达没有升高,与control组没有显著差异(S473G组尸=0.496,S473G-T308G组P=0.709)。结论1芹菜素能减轻ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变。2芹菜素能抑制OxLDL刺激的巨噬细胞活力增加,诱导巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡。3芹菜素可抑制OxLDL刺激的Akt磷酸化及PAI-2蛋白表达。4过表达Akt可上调PAI-2蛋白的表达,增加细胞的活力。5对Akt磷酸化ser473点突变后,OxLDL的刺激未能使巨噬细胞活力增加,也未能增加PAI-2蛋白的表达。6芹菜素能降低Akt过表达所致的细胞活力增加,并减少PAI-2蛋白的表达。综上所述,芹菜素能诱导巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡,其作用可能是由Akt/PAI-2信号通路介导,通过阻止Akt磷酸化Ser473的激活,从而阻止Akt磷酸化Ser473对PAI-2蛋白的调控来实现,对防治动脉粥样硬化有一定的指导意义。