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长期以来恶性肿瘤的治疗一直是医学上的一大难题。三大传统疗法并不能彻底根除肿瘤，且各自具有其局限性。随着分子生物学和基因工程技术的发展，生物治疗逐步显现了其巨大的发展前景。免疫治疗是综合治疗的一个重要组成部分，肿瘤特异性抗原的发现为肿瘤特异性免疫治疗开辟了一片新的天地。黑色素瘤抗原编码基因(melanoma antigen-encoding genes)又称为MAGE基因，最初在黑色素瘤中发现，它编码一类肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigens)。MAGE基因是一个基因超家族，目前至少发现有13个亚家族，包括MAGE-A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L2和necdin，其相互之间具有高度的同源性，主要定位于人的X染色体长臂。MAGE-A3抗原是其中A亚家族的一员，它在不同组织来源、不同病理类型的肿瘤中有不同程度表达，而在除了睾丸和胎盘之外的正常组织和良性肿瘤中不表达。它所编码的蛋白中某些多肽可经HLA-Ⅰ类分子递呈于细胞表面，被自体细胞毒性T淋巴细胞(autologous cytotoxic T lymphocyte，CTLs)识别，因而是一种CTLs介导的特异性免疫治疗的理想靶分子。目前所见多为关于MAGE-A3 mRNA表达的报道，关于其蛋白产物在肺癌中的报道较少。而且mRNA水平的MAGE-A3基因阳性表达并不等于MAGE-A3抗原蛋白的表达，只有抗原的表达才可诱导CTLs对该肿瘤细胞的特异性识别与杀伤，因此MAGE-A3抗原的表达与机体免疫应答的关系更直接、更密切。本实验室研究表明MAGE-A3的mRNA在肺癌中有较高的阳性郑州大学2朋3届硕士论文(论文部分)肺癌患者琳GEesA3抗原表达及HLA一工类基因分布的初步研究表达率(83.9%)，提示MAGE一A3编码的抗原蛋白可能在肺癌患者体内也有较高的表达。所以本课题应用W匕stem blot方法检测肺癌患者癌组织及癌旁组织中MAGE一A3抗原蛋白的表达情况。 在MAGE一A3抗原蛋白上存在许多抗原决定簇，它们可以与不同的HLA一I类分子相结合，诱导产生特异性的CT此来杀伤MAGE一A3阳性的肿瘤细胞。所以针对肿瘤细胞的特异性细胞免疫治疗的成败与否，在很大程度上取决于HLA一I类分子的参与。效应性T淋巴细胞上的TCR识别并结合HLA一I类分子/MAGE一A3抗原肤复合体后，该细胞才能被有效地激活。因此，了解MAGE一A3和HLA一I类分子在患者中的表达及分布情况，就可以初步估测应用MAGE一A3抗原肤对肺癌患者进行特异性免疫治疗的可能性。材料与方法1.标本收集:本研究共收集70例肺癌组织标本，72例肺癌的癌旁组织标本。离体40min内迅速放入一80℃冰箱保存。正常成人新鲜全血(3ml) 107例，4℃保存，于1周内提取DNA备用。2.蛋白的提取:参考《分子克隆实验指南》(第二版)。所提蛋白保存于一20℃。3 .DNA的提取:应用上海生工生物公司生产的UNIO一10柱式基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，保存于一20℃备用。4 .MAGE一A3抗原蛋白的检测:采用12%聚丙烯酞胺凝胶电泳(S DS一PAGE)分离组织总蛋白;将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上;57B一抗孵育;辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗孵育;二氨基联苯胺(DAB)显色。应用Bio Imaging system成像，保存结果并进行统计分析。5.PCR一SSP:根据引物设计的基本原则和已知的HLA一I类基因序列，设计序列特异性引物: HLA~Al(ExZ:113~130一Ex3:216~232); HLA一AZ(EXZ:149一167一Ex3:110~128); HLA一A24(ExZ:166~184一Ex3:195一213)。 以所提取的肺癌组织、癌旁组织以及正常成人对照组的DNA标本为模板在设计好的反应条件下进行PCR扩增反应。所得产物进行1.7%琼脂糖凝胶电泳，紫外郑州大学2003届硕士论文〔论文部分)肺癌患者以GE一A3抗原表达及现A一I类基因分布的初步研究灯下观察结果并记录。6.统计学处理:所获数据采用统计分析系统SPSS10.0软件处理。两个样本率的比较应用卡方检验。如果样本例数过少(n<40)，多个样本率的比较采用秩和检验。结果:1 .MAGE一A3抗原蛋白表达情况:共提取63例肺癌标本(包括癌组织和癌旁组织)的组织总蛋白。节几stem blot方法检测发现有31例癌组织为MAGE一A3抗原阳性。有犯例为MAGE一A3抗原阴性。MAGE.A3抗原在肺癌中的阳性率为49.21%。另外还在癌旁组织中发现有5例MAGE~A3表达阳性。2.HLA一I类基因分布情况:癌组织中HLA一Al、AZ和A24的阳性率分别为4.28% (3/70)、54.28%(38/70)和50.0()%(35刀0);癌旁组织中HLA~Al、AZ和八24的阳性率分别为4.17%(3/72)、 61.11%(44刀2)和54.17%(39刀2);正常对照组中HLA一Al、A2和A24的阳性率分别为4.67%(5/107)、46.73%(50/107)和38.32% (41/1 07)。在肺癌患者中HLA一Al、HLA~AZ、HLA确24的总阳性率为80.0% (56/70)。3.MAGE一A3抗原蛋白与HLA一I类基因分布均为阳性的个体在肺癌患者中的分布频率为80.0%x49.21%幻39.36%。结论:1 .MAGE一A3抗原蛋白在肺癌中的阳性表达率为49.21%，提示此抗原有可能成为肺癌患者免疫治疗的靶抗原。2 .PCR一SSP的HLA~1类基因分布情况与文献报道相似，在我国人群中HLA~AZ、Hl人一A24基因具有较高的分布频率，同时作为能够?