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第一章 草鱼(Ctenopharyngodon idellus)HMGCR基因的全长克隆、生物信息学分析及组织表达分析3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl Co A reductase,HMGCR)是内源性胆固醇合成的关键限速酶,在维持胆固醇稳态方面具有重要作用。本实验利用c DNA末端快速扩增(RACE)法获得了草鱼HMGCR基因的c DNA全序列。HMGCR全长3594bp,5’端非编码区(5’-UTR)长77bp,3’端非编码区(3’-UTR)长988bp,开放阅读框(ORF)为2529bp,编码842个氨基酸组成的多肽链,分子量91.48k D,理论等电点6.27。草鱼HMGCR蛋白包括两个结构域:氨基端复杂的复杂的跨膜区域(Asp62-Leu219)和羧基端细胞溶质催化区域(Asn419-Arg826),这两个序列通过一个可变的亲水接头序列(Val220-Ser418)连接起来,存在一个磷酸化位点(Ser827)和一个催化活性位点(His821),前39个氨基酸残基(Met1-Ala39)为信号肽。由氨基酸同源性分析和进化分析可知,草鱼HMGCR与斑马鱼、丽脂鲤等鲤科鱼类的进化关系较近,与斑马鱼的同源性最高(89%)。通过组织表达分析表明,草鱼HMGCR在被检测的7个组织中都有表达,其中在肝胰脏中的表达量最高,其次为肌肉、肾脏和心脏。研究结果为进一步开展对草鱼HMGCR调控胆固醇代谢的分子机制研究提供了理论依据。第二章 草鱼(Ctenopharyngodon idellus)CYP7A1基因的全长克隆、生物信息学分析及组织表达分析胆固醇7α羟化酶(cholesteral 7αhydroxylase,CYP7A1)是胆汁酸经典合成途径的关键限速酶,在维持胆汁酸稳态方面具有重要作用。本实验利用c DNA末端快速扩增(RACE)法获得了草鱼CYP7A1基因的c DNA全序列。CYP7A1全长1771bp,5’端非编码区(5’-UTR)长22bp,3’端非编码区(3’-UTR)长219bp,开放阅读框(ORF)为1530bp,编码509个氨基酸组成的多肽链。分子量57.74k D,理论等电点6.54。草鱼CYP7A1蛋白包括两个结构域:包含跨膜螺旋(Leu5-Leu22)的氨基端和包含保守核心序列的羧基端,其中氨基端疏水性强,保守性弱,而羧基端的半胱氨酸在这些物种中高度保守,前24个氨基酸(Met1-Ser24)为信号肽。由氨基酸同源性分析和进化分析可知,草鱼CYP7A1与斑马鱼、丽脂鲤等鲤科鱼类的进化关系较近,与斑马鱼的同源性最高(80%)。通过组织表达分析表明,草鱼CYP7A1在肝胰脏中的表达量最高,其次为肾脏,在其他组织的表达量很少。研究结果为进一步开展对草鱼CYP7A1调控胆固醇代谢的分子机制研究提供了理论依据。第三章 氧化鱼油对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝胰脏、肠道胆固醇、胆汁酸合成代谢相关酶基因表达的影响为了研究氧化鱼油对草鱼肝胰脏、肠道胆固醇、胆汁酸合成代谢的影响。以豆油、鱼油、氧化鱼油作为饲料脂肪源,分别设计鱼油组(6F)、豆油组(6S)、2%氧化鱼油(2OF)、4%氧化鱼油(4OF)及6%氧化鱼油(6OF)5组等氮、等能半纯化饲料,在池塘网箱养殖平均体重为(74.8士1.2)g草鱼72天。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)的方法,测定了草鱼肝胰脏、肠道组织中四种胆固醇合成相关酶HMGCR、SREBP2、CETP、ABCA1和胆汁酸合成关键酶CYP7A1的基因表达活性,结合血清、肝胰脏和肠道TC、TBA含量分析了胆固醇、胆汁酸的合成强度的变化。结果显示:(1)添加氧化鱼油后,草鱼肝胰脏HMGCR基因表达活性显著上调(P<0.05),ABCA1和CYP7A1基因表达活性显著下调(P<0.05),肝胰脏TC、TBA含量显著增加(P<0.05);(2)添加氧化鱼油后,草鱼肠道HMGCR基因表达活性显著上调(P<0.05),CYP7A1基因表达活性显著下调(P<0.05),肠道TC含量显著增加(P<0.05),而TBA含量显著减少(P<0.05);(3)添加鱼油或氧化鱼油后,饲料∑PUFA含量与肝胰脏ABCA1基因表达活性呈显著正相关关系(P<0.05),饲料MDA含量与肠道ABCA1基因表达活性呈显著负相关关系(P<0.05)。结果表明,随着饲料氧化鱼油添加量的增加,在饲料∑PUFA含量减少和鱼油氧化产物MDA含量增加的交互影响下,肝胰脏和肠道细胞胆固醇合成能力、向细胞内转运胆固醇的能力增强,向细胞外转运胆固醇的能力、以胆固醇为原料合成胆汁酸的能力减弱,致使肝胰脏、肠道、血清胆固醇含量增加、而血清、肠道胆汁酸含量减少。肝胰脏胆汁酸含量增加,显示肝胰脏有胆汁酸淤积的发展趋势。预示着鱼体生理代谢可能需要更多的胆固醇以满足生理代谢的需要,而鱼体胆汁酸可能出现供给不足。第四章 氧化鱼油对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)胆固醇、胆汁酸合成代谢关键酶基因的时空表达为了研究氧化鱼油对草鱼肝胰脏、肠道胆固醇、胆汁酸合成代谢在时间进程中的影响,探讨在氧化鱼油的影响下,肠道损伤与肝胰脏、肠道胆固醇、胆汁酸合成代谢的关系。以豆油、氧化鱼油作为饲料脂肪源,分别设计豆油组(6S)、2%氧化鱼油(2OF)、4%氧化鱼油(4OF)及6%氧化鱼油(6OF)4组等氮、等能半纯化饲料,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)的方法,测定了草鱼肝胰脏、肠道组织中胆固醇合成关键酶HMGCR和胆汁酸合成限速酶CYP7A1基因时序表达活性,并结合血清、肝胰脏和肠道TC、TBA含量分析了胆固醇、胆汁酸的合成强度的变化。结果显示:在10-30天添加氧化鱼油后,(1)血清、肝胰脏和肠道TC、TBA含量都显著下调(P<0.05),此时,草鱼肝胰脏和肠道HMGCR基因表达活性显著上调(P<0.05),CYP7A1基因表达活性显著下调(P<0.05);(2)肠道Occludin基因表达活性和血清DAO含量显著下调(P<0.05);(3)饲料MDA含量与肝胰脏、肠道HMGCR基因表达活性均显示正相关关系的变化趋势,而与CYP7A1基因表达活性均显示负相关关系的变化趋势;(4)饲料∑PUFA含量与肝胰脏、肠道HMGCR基因表达活性均显示负相关关系的变化趋势,而与CYP7A1基因表达活性均显示负相关关系的变化趋势。在10-30天随着氧化鱼油添加量的增加,在草鱼肝胰脏、肠道胆固醇含量减少的情况下,由于饲料∑PUFA含量减少和MDA含量增加的共同作用,引起了肝胰脏和肠道胆固醇合成能力的增强、胆汁酸合成能力的减弱,致使肝胰脏、肠道胆汁酸含量降低。氧化鱼油可能通过损伤肠道黏膜的方式先对肠道胆固醇、胆汁酸合成代谢造成影响,再对肝胰脏胆固醇、胆汁酸合成代谢造成影响。第五章 丙二醛对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝胰脏、肠道胆固醇、胆汁酸合成代谢相关酶基因表达的影响为了研究MDA对草鱼肝胰脏、肠道胆固醇、胆汁酸合成代谢的影响。以豆油为饲料脂肪源,根据等氮等能的原则,设置了一个对照组和三个MDA处理组的试验饲料,在池塘网箱养殖平均体重为(74.8士1.2)g草鱼72天。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)的方法,测定了草鱼肝胰脏、肠道组织中四种胆固醇合成相关酶HMGCR、SREBP2、CETP、ABCA1和胆汁酸合成关键酶CYP7A1的基因表达活性,结合血清、肝胰脏和肠道TC、TBA含量分析了胆固醇、胆汁酸的合成强度的变化。结果显示:在饲料中添加MDA后,(1)草鱼肝胰脏HMGCR、SREBP2、CETP基因表达活性显著上调(P<0.05),ABCA1和CYP7A1基因表达活性显著下调(P<0.05),肝胰脏TC含量显著增加(P<0.05),TBA含量显著减少(P<0.05);(2)草鱼肠道HMGCR、SREBP2、CETP、ABCA1、CYP7A1基因表达活性显著下调(P<0.05),肠道TC含量显著增加(P<0.05),TBA含量显著减少(P<0.05);(3)饲料MDA含量与肝胰脏HMGCR、SREBP2、CETP基因表达活性均显示正相关关系的变化趋势,而ABCA1、CYP7A1基因表达活性均显示负相关关系的变化趋势;(4)饲料MDA含量与肠道HMGCR、SREBP2、CETP、ABCA1、CYP7A1基因表达活性均显示负相关关系的变化趋势。结果表明,随着饲料MDA含量的增加,肝胰脏胆固醇合成能力、向细胞内转运胆固醇的能力增强,而肠道都在减弱,肝胰脏、肠道向细胞外转运胆固醇的能力、以胆固醇为原料合成胆汁酸的能力减弱,致使肝胰脏、肠道、血清胆固醇含量增加,而胆汁酸含量减少。预示鱼体可能需要更多的胆固醇以满足生理代谢的需要,而鱼体需要的胆汁酸可能出现供给不足。第六章丙二醛对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)胆固醇、胆汁酸合成代谢关键酶基因的时空表达为了研究MDA对草鱼肝胰脏、肠道胆固醇、胆汁酸合成代谢在时间进程中的影响,探讨在MDA的影响下,肠道损伤与肝胰脏、肠道胆固醇、胆汁酸合成代谢的关系。以豆油作为饲料脂肪源,分别设计对照组(6S)、MDA-1、MDA-2、MDA-3共4组等氮、等能半纯化饲料,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)的方法,测定了草鱼肝胰脏、肠道组织中胆固醇合成关键酶HMGCR和胆汁酸合成限速酶CYP7A1基因时序表达活性,并结合血清、肝胰脏和肠道TC、TBA含量分析了胆固醇、胆汁酸的合成强度的变化。结果显示:在10-30天添加MDA后,(1)血清、肝胰脏和肠道TC、TBA含量都显著下调(P<0.05),此时,草鱼肝胰脏和肠道HMGCR基因表达活性显著上调(P<0.05),CYP7A1基因表达活性显著下调(P<0.05);(2)肠道Occludin基因表达活性和血清DAO含量显著下调(P<0.05);(3)饲料MDA含量与肝胰脏HMGCR基因表达活性均显示正相关关系的变化趋势,与肝胰脏、肠道CYP7A1基因表达活性均显示负相关关系的变化趋势。在10-30天随着饲料添加MDA浓度的增加,在草鱼肝胰脏、肠道胆固醇含量减少的情况下,肝胰脏和肠道胆固醇合成能力会增强、胆汁酸合成能力会减弱,导致了肝胰脏和肠道胆汁酸含量的减少。MDA可能通过损伤肠道的方式先对肠道胆固醇、胆汁酸合成代谢造成影响,随后再对肝胰脏胆固醇、胆汁酸合成代谢造成影响。