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目的:通过体外培养人支气管上皮细胞(Human Brochil Epithelial,16HBE)实验,研究泛素连接酶Ring2对苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene,Ba P)染毒人支气管上皮细胞后DNA损伤和细胞周期改变的影响,初步探讨组蛋白泛素化在DNA损伤修复中的作用。方法:16HBE和16HBE(si RNA-Ring2)细胞分别用不同浓度(0、1、2、4、8、16和32μmol/L)Ba P染毒24h和16μmol/L Ba P染毒不同时点(0、1、2、4、8、12和24h)。以酶联免疫吸附和免疫组化的方法检测各组细胞中BPDE-DNA加合物的水平,用来反映DNA损伤情况;以流式细胞术和蛋白印迹技术来分别检测细胞周期的变化和细胞增殖性核抗原的表达,用来反映细胞周期的变化情况。结果:1、DNA损伤检测:(1)酶联免疫吸附试验ELISA实验:与正常对照组相比,16HBE和16HBE(si RNA-Ring2)细胞用不同浓度Ba P染毒24h后BPDE-DNA加合物的浓度均数都随着染毒浓度的增加而明显增加(P=0.016;P=0.001)。协方差分析结果显示16HBE(si RNA-Ring2)细胞组修正(1.627)与16HBE细胞组(1.233)相比显著增高(P<0.01)。与正常对照组相比,16HBE和16HBE(si RNA-Ring2)细胞用16μmol/L Ba P染毒不同时间后BPDE-DNA加合物的浓度均数都随着染毒时间的增加而明显增加(P=0.003;P=0.011)。协方差分析结果显示16HBE(si RNA-Ring2)细胞组BPDE-DNA加合物的修正均数(1.838)比16HBE细胞组(1.273)显著增高(P<0.01)。(2)免疫组化实验:以16μmol/L染毒16HBE(Si RNA-Ring2)和16HBE 4h后显示,16HBE(Si RNA-Ring2)细胞内绿色荧光比16HBE细胞明显增强,提示干扰后细胞经染毒生成BPDE-DNA加合物比正常细胞染毒后增多。2、细胞周期变化检测:(1)流式细胞仪检测:与正常对照组相比,16HBE和16HBE(si RNA-Ring2)细胞用不同浓度Ba P染毒24h后,16HBE细胞S期细胞所占比例的均数随着染毒浓度的增加而明显增加,16HBE(si RNA-Ring2)细胞则呈下降趋势。协方差分析结果显示16HBE(si RNA-Ring2)细胞组的修正均数(17.09%)比16HBE细胞组(31.55%)明显降低(P<0.01)。与正常对照组相比,16HBE和16HBE(si RNA-Ring2)细胞用16μmol/L Ba P染毒不同时间后,16HBE细胞S期细胞所占比例的均数随着染毒时间的增加而明显的增加,16HBE(si RNA-Ring2)细胞则呈现下降趋势。协方差分析结果显示16HBE(si RNA-Ring2)细胞组的修正均数(13.07%)比16HBE细胞组(28.04%)明显下降(P<0.01)。(2)蛋白印迹实验:不同浓度Ba P染毒16HBE后,可以看见在4、8、16和32μmol/L组PCNA的表达增多,比率增加明显,有统计学意义(P<0.01)。16μmol/L Ba P染毒16HBE细胞不同时点(0、1、2、4、8、12、24h),随着染毒时间的增加,PCNA的表达量也随之增加,且有明显的时间效应。PCNA在1、2、4、8、12、24h的各染毒时点与阴性对照相比,均有显著差异(P<0.01)。16μmol/L Ba P染毒16HBE细胞和16HBE(Si RNA-Ring2)细胞4h引起PCNA的表达改变,16HBE细胞的PCNA表达增加,而16HBE(Si RNA-Ring2)细胞的表达降低。结论:1、正常细胞用Ba P染毒后DNA损伤有明显的剂量效应和时间效应;2、泛素连接酶Ring2表达降低的细胞对Ba P染毒引起的DNA损伤更加敏感;3、泛素连接酶Ring2表达降低的细胞对Ba P染毒引起的DNA损伤更加敏感可能与S期的缩短有关系,这可能是DNA损伤更加严重的原因之一。