结肠癌(Colon cancer)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。随着我国经济和社会的发展以及生活方式的改变,这种疾病在我国的发病率呈快速上升趋势,成为了严重危害人类健康的“杀手”。结肠癌的常规治疗手段包括手术、化疗、放疗以及靶向治疗,但总体疗效并不令人满意。近年来,免疫检查点抑制剂(如PD-1、PD-L1抗体)的问世为许多恶性肿瘤的治疗带来了新的希望。但遗憾的是,PD-1抑制剂治疗结肠癌的效果是十分有限的。因此,为了解决这一难题,已有许多研究将PD-1抑制剂与其他抗肿瘤治疗(例如化学治疗,靶向治疗,放疗或其他免疫治疗等)联合应用,并取得了一定成效。中医药作为我国的瑰宝,在疾病的治疗中起着重要的作用。中药联合化疗、放疗等手段在肿瘤的治疗中亦取得了较好的治疗效果。中西医联合治疗结肠癌等恶性肿瘤已经得到了广泛认可。但目前对于中药联合PD-1抑制剂治疗结肠癌的研究尚无报道。本研究通过观察葛根芩连汤(Gegen Qinlian Decoction,GQD)联合PD-1抑制剂对治疗结肠癌皮下移植瘤模型有无疗效;随后采用流式细胞术、免疫组织化学、免疫荧光等方法研究联合治疗对肿瘤免疫微环境的影响;最后利用16S rDNA高通量测序及代谢组学技术进一步探讨GQD联合PD-1抑制剂抗肿瘤可能作用的机制,从而为GQD联合PD-1抑制剂治疗结肠癌提供理论依据。第一部分基于网络药理学分析葛根芩连汤对结直肠癌患者免疫状态的影响目的:基于中药网络药理学,寻找GQD对结肠癌治疗的可能作用机制,并探讨GQD对结直肠癌患者外周血T细胞亚群变化的影响。方法:1.基于药理学数据库对GQD活性化合物筛选,构建候选化合物-靶点网络,与结肠癌相关基因数据库(OMIM,GAD和TTD)进行比对、分析和去重,寻找与结肠癌作用的相关靶点蛋白。并且对筛选出的化合物靶点蛋白和结肠癌靶点蛋白进行蛋白互作分析(Protein and protein interac-tion,PPI)。最后对PPI中核心靶点蛋白进行GO和KEGG富集分析,寻找GQD可能在结肠癌中发挥作用的关键通路。2.选取河北医科大学第四医院自2018年7月1日到2019年1月1日组织学确诊为结直肠癌的患者20例。采用流式细胞术,检测GQD用药前后结直肠癌患者外周血CD8+T细胞和CD4+T细胞的比例。结果:1.从GQD中共获得了126种候选化合物,260个潜在候选靶点蛋白,150个结肠癌相关靶点蛋白,79个潜在的核心靶点蛋白。并且发现这些核心靶点蛋白可能参与肿瘤的发生发展,以及T细胞和B细胞相关信号通路。2.结直肠癌患者应用GQD后与用药前相比外周血淋巴细胞中CD4+T细胞的比例明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而CD8+T细胞的比例无明显变化。小结:GQD在结肠癌中作用的靶点蛋白主要参与了肿瘤发生发展以及T细胞、B细胞等免疫相关信号通路;GQD可能改善结直肠癌患者的全身免疫状态。第二部分葛根芩连汤联合PD-1抑制剂治疗结肠癌的疗效观察及其对免疫微环境的影响目的:,探讨GQD联合PD-1抑制剂对结肠癌荷瘤小鼠肿瘤生长的影响,以及联合治疗对荷瘤小鼠免疫状态和肿瘤免疫微环境的影响。方法:1.构建结肠癌细胞系(CT26)诱导的皮下移植瘤模型。共设8组,分别为A组:低剂量GQD(L-GQD:300mg/kg/d)+PD-1抑制剂组;B组:中剂量GQD(M-GQD:1500mg/kg/d)+PD-1抑制剂组;C组:高剂量GQD(H-GQD:7500mg/kg/d)+PD-1抑制剂组;D组:L-GQD组;E组:M-GQD组;F组:H-GQD组;G组:PD-1抑制剂组;H组:对照组。随后我们评估了各组肿瘤体积及肿瘤生长抑制率(tumour growth inhibition rate,TGI),并收集实验动物的肿瘤样本、外周血以及粪便。2.运用流式细胞术,检测实验分组中的A组、D组、G组以及H组荷瘤小鼠外周血CD8+T细胞和CD4+T细胞的比例。3.采用免疫组织化学及免疫荧光技术,检测A组、D组、G组以及H组荷瘤小鼠肿瘤组织内CD8+T细胞的表达差异。4.采用酶联免疫吸附技术测定以上4组小鼠肿瘤组织内IFN-、IL-2、IL-6、IL-17,TGF-β以及PD-1的表达量。结果:1.灌胃32d小鼠,A、B、C三组肿瘤体积均小于H组(P<0.01),且A组vs.H组差异最明显;A组肿瘤体积小于G组,有统计学差异(P<0.05);G组肿瘤体积小于H组,有统计学差异(P<0.01);D、E、F单用中药各组肿瘤体积与H组相比无明显差异;A、B、C三组间以及D、E、F三组间比较肿瘤体积无明显差异。2.A组、D组、G组小鼠外周血淋巴细胞中CD8+T细胞的比例均高于H组,差异有统计学意义(P<0.05),且A组vs.H组的差异最明显(P<0.01)。但以上三组与H组相比,CD4+T细胞比例均无统计学差异。3.免疫组化结果显示:A组小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞的表达明显高于H组,差异有统计学意义(P<0.05)。D组、G组与H组相比,小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞比例均无统计学差异。4.A组小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞的荧光强度明显高于其他各组。5.ELISA结果显示:A组小鼠肿瘤组织内IFN-和IL-2的表达均明显高于H组,差异有统计学意义(P<0.05)。A组PD-1的表达明显低于H组,差异有统计学意义(P<0.01)。而IL-17,IL-6,TGF-β的表达在各组间无统计学差异。小结:GQD联合PD-1抑制剂可增强对荷瘤小鼠的抗肿瘤疗效;GQD联合PD-1抑制剂还可改善荷瘤小鼠外周血免疫状态,并重塑肿瘤免疫微环境。第三部分葛根芩连汤联合PD-1抑制剂对结肠癌肠道菌群的影响及代谢组学分析目的:基于荷瘤小鼠粪便16S rDNA测序和外周血代谢组学分析,筛选联合治疗后的差异菌群以及代谢产物,探讨GQD联合PD-1抑制剂通过重塑免疫微环境治疗结肠癌的机制。方法:1.分别对PD-1抑制剂治疗前的两个组:应用GQD组(GQD组:A组+D组);未应用GQD组(Non-GQD组:G组+H组)以及治疗后4个组(A组、D组、G组和H组)荷瘤小鼠的粪便进行16S rDNA测序,进行OTU分析、PCA分析,物种多样性分析以及组间物种差异分析,并筛选在门、属、种水平上的差异菌群。2.收集4组(A组、D组、G组和H组)荷瘤小鼠PD-1抑制剂治疗后的血清样本,进行超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS)分析,筛选差异代谢物,并于与数据库进行比对,从而获得差异代谢物及可能参与的信号通路。结果:1.PD-1抑制剂治疗前小鼠粪便16S rDNA测序分析本实验共得到2629590个有效序列(序列平均长度252.6091528),664258502个有效碱基,263个OTU(Operational Taxonomic Units)。在属水平得到9个显著差异物种,在种水平得到14个显著差异物种,其中s＿unclassified＿f＿Erysipelotrichaceae在GQD组中明显富集,而s＿uncultured＿organism＿g＿norank＿f＿Peptococcacea和s＿uncultured＿g＿norank＿f＿Bacteroidales＿S24＿7＿group在Non-GQD组中明显富集。2.PD-1抑制剂治疗后小鼠粪便16S rDNA测序分析本实验共得到了2692871个有效序列(序列的平均长度为252.5071873),679969282个有效碱基,318个OTU。D组vs.H组在属水平得到17个显著差异物种,在种水平得到29显著性差异物种;G组vs.H组,在属水平得到7个显著性差异物种,在种水平得到17个显著性差异物种;A组vs.H组,在属水平得到13个显著性差异物种,在种水平得到26个显著性差异物种,其中s＿Bacteroides＿acidifaciens和s＿uncultured＿organism＿g＿norank＿f＿Bacteroidales＿S24-7＿group在A组显著富集,而s＿uncultured＿bacterium＿g＿norank＿f＿Bacteroidales＿S24-7＿group和s＿uncultured＿Bacteroidales＿bacterium＿g＿norank＿f＿Bacteroidales＿S24-7＿group在H组显著富集。A组vs.G组,在属水平得到10个显著性差异物种,在种水平得到12个显著性差异物种,其中s＿Bacteroides＿acidifaciens在A组显著富集,cteroidales＿bacterium＿g＿norank＿f＿Bacteroidales＿S24-7＿group在G组显著富集。3.L-GQD联合PD-1抑制剂对小鼠血清代谢组学的影响在本实验共检出负离子模式化合物2554个,正离子模式化合物3504个。D组vs.H组获得391个差异代谢物;G组vs.H组获得308个差异代谢物;A组vs.H组获得322个差异代谢物,且A组vs.H组特有的差异化合物有158个,主要富集通路为甘油磷脂代谢和鞘脂类代谢。对差异代谢物进行分级聚类,A组中丰度较高的代谢物,主要包括Lyso PC(20:3(5Z,8Z,11Z)),vignatic acid B,Lyso PE(0:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)),Lyso PE(0:0/20:2(11Z,14Z))和PI(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/16:0);A组中丰度较低的代谢物,主要包括(1a S,5R,6R,9a R)-6-[2,6-dideoxy-2-(methylamino)],isopeonidin 3-rutinoside,glycerol 2-(9Z,12Zoctadecadienoate),tetraethylene glycol和pentadecanoylglycine。小结:GQD联合PD-1抑制剂可能通过改善肠道菌群,以及某些特定代谢产物,增强对结肠癌的治疗疗效。结论:1.GQD在结肠癌中作用的靶点蛋白主要参与了肿瘤发生发展以及T细胞、B细胞等免疫相关信号通路;GQD可能改善结直肠癌患者的全身免疫状态。2.GQD联合PD-1抑制剂可增强对荷瘤小鼠的抗肿瘤疗效;GQD联合PD-1抑制剂还可改善荷瘤小鼠外周血免疫状态,重塑肿瘤免疫微环境。3.GQD联合PD-1抑制剂可能通过改善肠道菌群,以及某些特定代谢产物,增强对结肠癌的治疗疗效。