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本研究采用由大连理工大学化学生物学课题组设计、合成的8H-H-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈衍生物1a(3-(4-甲基哌嗪)-8-氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈)和3a(3-(3-N,N-二甲氨基-丙氨基)-8-氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈)为研究工具,研究了不同程度的DNA构象改变在DNA损伤信号转导中的作用。
在确定了1a和3a与DNA的结合模式的基础上,证明它们嵌入DNA双螺旋后,对于DNA双螺旋具有不同程度的解旋作用。通过免疫细胞荧光染色,研究细胞内的Ataxia-telangiectasia mutated(ATM)蛋白激酶能够响应1a和3a的胁迫,证明了一种新的能够被细胞信号转导通路蛋白ATM监测到的DNA损伤形式,同时确定了1a和3a是一对新的可以用来研究DNA损伤信号转导通路的DNA拓扑结构探针。
利用1a和3a具有不同程度解旋DNA的特性,研究了ATM、RNAPII、p53等蛋白在DNA损伤信号转导中的作用、协同机制和影响因素。1a触发的ATM磷酸化强于3a,因此得出结论:ATM的激活程度与DNA解旋程度相关。另外,结合流式细胞术、免疫细胞染色、ChIP、定量PCR(Q-PCR)和Westem blot,研究了培养细胞在1a和3a的胁迫下,p53的积累及磷酸化,RNAPII的超磷酸化和次磷酸化,以及RNAPII在转录基因上分布动力学,发现1a可以诱导转录阻滞,最终引发依赖p53的凋亡,而3a则不可以。以上的研究显示,转录阻滞和DNA解旋的程度相关。进一步的研究发现,在染色质构象改变的过程中,是转录阻滞而不是ATM的激活触发了p53的响应。这说明转录是更敏感的抗癌作用靶点。
本研究筛选出一对新的可以用来半定量研究DNA构象损伤信号的DNA拓扑结构探针,并提出了ATM、p53和RNAPII在染色质构象改变诱导的凋亡通路中的作用机制。