小鼠（Mus musculus, mouse）是生物医学中应用最广泛的实验动物之一,随着现代生物医学的不断发展,基因功能的比较研究、人类疾病发生机制的研究及药物开发等需要越来越多不同类型的模型动物。小鼠因其与人类的基因组序列、生化代谢及生理特点的相似性而成为研究人类基因功能和疾病最理想的模式动物。小鼠模型的获得有自然突变、诱变、基因陷阱、转基因或基因敲除等多种方式。snthr-1Bao稀毛小鼠（注:本稀毛小鼠由The Jackson Lab专家指导命名,尚未递交到MGI（Mouse Genomic Informatics））是本实验室2002年通过ENU（乙酰基亚硝基脲）诱变获得的一种呈隐性遗传的突变种,背景品系为DBA/2,最显著的可见表型为被毛稀疏。我们通过遗传学手段,采用基因组扫描的办法将snthr-1Bao小鼠突变基因初步定位于第9号染色体,距着丝粒71cM处。被毛突变小鼠是皮肤科学研究的绝好材料,定位、克隆被毛突变基因能够揭示被毛脱落的分子机制。更为重要的是,通过同源检索可以找到人类的相关基因,为人类疾病的研究提供新的思路,探询药物治疗的新靶点。本文对snthr-1Bao稀毛小鼠的生物学特性进行了较为详细的研究,精确定位了稀毛突变基因以及对该稀毛小鼠毛发调节基因的QTL（quantitative trait loci,数量性状基因座）进行了初步定位。我们的工作分为四个部分:1. snthr-1Bao稀毛小鼠的生物学特性对稀毛小鼠snthr-1Bao和对照组DBA/2小鼠的生长情况、繁殖性能、形态学、大体解剖学和血液生理指标进行了观察。从两种品系仔鼠初生起每周称取仔鼠的重量直至12周龄,比较它们的生长情况并观察稀毛小鼠snthr-1Bao和对照组DBA/2小鼠每窝的产子情况。分别取25只2月龄snthr-1Bao小鼠和对照组DBA/2小鼠称重后脱颈椎处死,解剖观察各内脏器官的位置和形态结构,取它们的心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、脑、生殖器官等脏器去淤血后称重,比较脏器的绝对重量和脏器系数。分别取20只（公母各10只）2月龄snthr-1Bao小鼠和对照组DBA/2小鼠眶静脉采血,大约300μl置于加有抗凝剂的指形管中,用于生理指标的分析。结果snthr-1Bao小鼠初生重比对照组DBA/2小鼠轻,四周前每周体重较DBA/2小鼠亦轻,4周龄后公鼠体重与对照差异不大,雌鼠直至成年均较背景品系轻,表明snthr-1Bao小鼠的生长发育较DBA/2小鼠迟缓,而且被毛异常,呈稀疏状。在繁殖学特性方面,snthr-1Bao小鼠与DBA/2小鼠相比雄性睾丸组织绝对重量和脏器系数均比DBA/2小,差异呈极显著性（p﹤0.01）;雌性子宫卵巢的脏器系数较DBA/2母鼠小,差异均呈极显著性（p﹤0.01）;断奶仔数比DBA/2小鼠少,差异呈极显著性（p﹤0.01）。对大体解剖学特性的观察表明,两种品系小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、脑、生殖器官等脏器的位置、形态结构间无差异,但有些脏器的绝对重量和脏器系数存在品系间差异（p﹤0.05或p﹤0.01）。血液生理指标方面两种品系小鼠相比在白细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜碱细胞的数量上存在差异（p﹤0.01）。因此,该突变不仅影响snthr-1Bao小鼠被毛的正常生长,还影响小鼠的生长发育、脏器的绝对重量和脏器系数、繁殖性能及血液生理指标。2. snthr-1Bao小鼠各组织的病理变化及皮肤的生长发育分别取2月龄snthr-1Bao稀毛小鼠和正常DBA/2小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、淋巴结、胸腺、睾丸附睾、卵巢子宫、肠组织、肠淋巴结等脏器,用10%福尔马林固定、脱水、包埋后行石蜡切片,HE染色,观察snthr-1Bao稀毛小鼠各脏器的病理变化。分别取snthr-1Bao稀毛小鼠和DBA/2小鼠胚胎期18.5天、初生、1周龄、2周龄、1月龄、2月龄时期的背部皮肤,同样用10%福尔马林固定、脱水、包埋后行石蜡切片,HE染色,观察snthr-1Bao稀毛小鼠皮肤的发育情况及病理变化。观察组织病理切片,snthr-1Bao稀毛小鼠除皮肤外其它内脏器官均无明显病理变化。发现初生到1周龄前两种小鼠的皮肤无较大差异,部分毛囊开始发育,皮下脂肪和皮脂腺开始出现,皮肤结构未见异常。1周龄到2周龄时,snthr-1Bao小鼠表皮及真皮层较厚,表皮及毛囊角化显著,皮脂腺增多。毛根排列不规则,部分毛发出现卷曲,不能长出皮肤表面。真皮内成纤维细胞增多,处于瘢痕形成阶段。随着年龄的增加,snthr-1Bao小鼠皮肤病变加重。1月龄时,snthr-1Bao小鼠皮肤棘细胞层肥厚,与对照比明显增加数倍,表皮及毛囊角化显著。部分毛发在皮内卷曲、横生,未能穿出皮肤,仍有部分毛发尚正常生长。皮下纤维细胞显著增多,排列紊乱,呈陈旧疤痕状。虽然随着小鼠年龄的增加,皮肤厚度变薄,皮脂腺数量增加,但与对照DBA/2小鼠相比snthr-1Bao小鼠的皮肤厚度仍然显著增加,皮脂腺数量增加得更多。因此snthr-1Bao小鼠皮肤组织病变始发于出生后1～2周,随年龄增长,病变加重。皮肤的原发病变是棘层肥厚、角化过度及部分毛发结构有缺陷。继发病变则包括毛发皮内卷曲,皮肤损伤并引发局部非感染性炎症,继而导致疤痕形成。3. snthr-1Bao小鼠突变基因的精确定位及候选基因提出先前的研究中,我们利用145只F2小鼠[（C57BL/6J×DBA/2）F1]互交及D9Mit18将突变基因定位于小鼠第9号染色体距着丝粒71cM处。为了进一步更精确定位该突变基因,需要扩大繁殖F2代小鼠、选择更多靠近突变基因的基因组标记。我们共繁殖F2小鼠4500余只,其中筛查到具有稀毛表型的F2小鼠1100只,提取这部分小鼠基因组DNA,PCR扩增后分析基因型。并在D9Mit18（距着丝粒119987Kb）两端共选取了16个STS、2个微卫星、35个SSR及3个SNP标记,设计合成引物,PCR扩增后电泳,筛选在DBA/2和C57BL/6JJ间呈多态性的标记。结果筛选到D9Mit151 （据着丝粒121180Kb ）、SSR NC₀00075₆0440₆1095（据着丝粒119129Kb）、2个SNP rs8254361（据着丝粒119332Kb）和rs30195705（据着丝粒117761Kb）共4个基因组标记在DBA/2和C57BL/6J间呈多态性的标记,PCR产物经电泳后可将DBA/2和C57BL/6J区分开。经过对1100只F2小鼠的检测,突变基因与D9Mit18有10例交换,与D9Mit151间有28例交换,与rs8254361间共出现3例交换,与NC₀00075₆0440₆1095间也有3例交换,而与rs30195705有15例交换。由于使用了1100只F2小鼠,实际能够反映2200例染色体交换情况,定位精度已在100/2200=0.05cM左右。经计算突变基因在距着丝粒117762Kb～119129Kb间,大约1.3Mb。搜索小鼠基因组数据库,发现期间共有已发现的基因15个,其中Itga9、Golga4、Azi2、Dlec1、Oxsr1、2010110K16RiK、Ctdspl、Vill、Plcd1、Acaa1b共10个基因在皮肤有表达。用FQ-PCR检测这10个基因在snthr-1Bao小鼠和DBA/2小鼠皮肤中的表达量,发现基因Itga9高表达,基因Azi2和Plcd1低表达。但对Itga9测序未发现突变。查询资料发现Plcd1基因敲除小鼠与snthr-1Bao小鼠表型及其相似。综合生物学特征研究、精确定位、FQ-PCR检测及数据库资料,我们确定Plcd1为snthr-1Bao小鼠的强力候选基因。本研究为克隆稀毛突变基因打下了坚实的基础。4. snthr-1Bao小鼠毛发调节基因的QTL定位观察到snthr-1Bao小鼠与C57BL/6J杂交后的F1代再互交得到的F2代小鼠的稀毛表型不同于亲代snthr-1Bao小鼠,其稀毛表型可以分为三种:多毛发型、少毛发型和毛发数量处于中间的中间型。我们的猜测是,在对突变基因定位交配的过程中可能有相关基因从C57BL/6J介入到F2小鼠中,调节了本来突变基因的功能。基于这一设想,我们设计了一个新的QTL位点的基因定位策略来寻找这些相关基因:将F2稀毛小鼠按照毛发疏密的程度取其2个极端类型:多毛发型和少毛发型,提取这些小鼠的基因组DNA;并在小鼠19条常染色体上选取了35个微卫星对70个多毛发型F2样本和57个少毛发型样本进行了全基因组扫描,分析每个样本在每个位点上的基因型,计算基因频率。然后利用R/qtl1.04-53软件,通过线性回归模式和Logistic回归分析,以染色体位点显著性水平的阈值p为0.63且LOD值超过2为标准分析可能存在的QTL,发现D4Mit17、D11Mit258、D12Mit136、D14Mit50和D15Mit34五个位点可作为候选QTL。接着进行QTL的单基因效应分析,分别计算这5个候选位点与毛发疏密之间的效应关系,发现D4Mit17和D15Mit34两个位点有使毛发增加的效应,而D11Mit258、D12Mit136和D14Mit50三个位点则有使毛发变稀少的效应。在这些分析结果的基础上,针对这5个候选QTL详细比较分析他们之间的可能的互作效应。经过三次运算,我们发现D11Mit258、D14Mit50和D15Mit35相互间有相互作用的关系,且统计学效应十分显著,p值均小于0.01,LOD值都在2.3以上。本实验成功发现了分别导致F2代小鼠毛发增加的D15Mit34位点和毛发减少的D11Mit258和D14Mit50两个位点。这些调节位点附近的基因与snthr-1Bao极有可能在同一分子信号过程中相互作用,调节毛发的生长发育。这对进一步研究snthr-1Bao稀毛小鼠的表型分子机制及寻找药物靶点提供了极好的线索。