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红曲霉（Monascus）是一种丝状真菌,属散囊菌目,红曲菌科,红曲霉属。工业上,红曲霉作为一种重要的微生物资源,用来生产色素以及Y-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid or4-Aminobutyrate,GABA）等其他有用化合物.GABA属于非蛋白氨基酸,存在于哺乳动物的脑部,是一种重要的抑制性神经递质,对于头痛、耳鸣以及由中风和脑动脉硬化引起的健忘症等具有一定的疗效,还可以增加供氧量,加速脑细胞代谢。在红曲霉中,GABA代谢主要涉及到两种重要的酶,即谷氨酸脱羧酶（G1utamate decarboxylase,GAD）和GABA转氨酶（4-Aminobutyrate aminotransferase,GABA-T）.GAD催化谷氨酸生成GABA, GABA-T催化GABA生成琥珀酸半醛（succinic semialdehyde,SSA）。近年来,有众多研究报道了通过红曲霉的菌种选育和发酵条件优化来提高GABA的产量,但是从分子水平调控GABA的生产却鲜见报道,而关于GABA代谢相关的酶GAD和(GABA-T的基因序列更是无从查询。本研究以实验室筛选保存的红色红曲霉Mr-5菌株（CGMCC NO.M208043）为实验材料,提取了红曲霉总RNA,合成了cDNA；通过比对几种曲霉属（Aspergillus）物种的GAD和GABA-T基因序列,根据保守区设计了简并引物；利用RACE技术和Touchdown PCR技术扩增获得了红色红曲霉GAD和GABA-T基因的序列；采用在线分析及相应软件分析预测了GAD和GABA-T的组成、理化性质、信号肽以及高级结构等；利用实时荧光定量PCR技术分析了GAD和GABA-T基因的相对表达情况；对GAD基因进行了原核表达,分离纯化后得到了目的蛋白。主要结果如下：1.红色红曲霉Mr-5GAD的基因序列红色红曲霉的Mr-5GAD基因全长cDNA序列全长为1784bp,包含一个1536bp的编码GAD基因的开发阅读框（ORF）,还有152bp的5’-UTR序列和96bp的3’-UTR序列。红色红曲霉GAD基因的核苷酸序列与黑曲霉（Aspergillus niger）的相似性为80%,与新萨托菌（Neosartorya fischeri）和棒曲霉（Aspergillus clavatus）的相似性都为79%。2.红色红曲霉Mr-5GAD的生物信息学分析红色红曲霉Mr-5GAD基因序列全长1536bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,编码511个氨基酸,其中67个氨基酸带负电荷,59氨基酸个带正电荷；理论分子量和等电点（PI）分别为57789.7Da和6.05,分子式为C2562H4004N704O768S26;脂溶指数为82.41,疏水指数为-0.330,属于亲水性蛋白；二级结构中αα-螺旋比例为54.41%,延伸链比例为30.72%,β-转角占7.24%,无规卷曲占7.63%;三级结构模型显示与该GAD蛋白含有大量的αα-螺旋和p-折叠,与二级结构的预测结果相符。保守结构域检测结果显示该序列有GAD功能位点,催化位点的氨基酸是赖氨酸（Lys, K）,结合位点由8个氨基酸构成。构建的系统进化树显示红色红曲霉的GAD与烟曲霉（Aspergillus fumigatus）等几种曲霉的GAD在进化关系上最为接近。Blastp结果显示其与烟曲霉（A.fumigatus）和新萨托菌（N. fischeri）的GAD氨基酸序列同源性最高,都为84%。3.红色红曲霉Mr-5GABA-T的基因序列红色红曲霉Mr-5GABA-T的基因序列全长1563bp。Blastn比对结果显示该基因的核苷酸序列与棒曲霉（A. clavatus,登录号XM001274002.1）、黑曲霉（A. niger,登录号XM001398283.2）和土曲霉（Aspergillus. terreus,登录号XM001217976.1）的相似性都为82%,与烟曲霉（A. fumigatus,登录号XM748872.1）的相似性为81%。4.红色红曲霉Mr-5GABA-T的生物信息学分析红色红曲霉Mr-5GABA-T基因序列全长1563bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,编码520个氨基酸,其中49个氨基酸带负电荷,56氨基酸个带正电荷；理论分子量和等电点（PI）分别为57534.9Da和9.12,分子式为C2595H4063N715O740S13;脂溶指数为87.50,疏水指数为-0.216,属于亲水性蛋白；二级结构中α-螺旋比例为47.12%,延伸链比例为31.15%,β-转角占9.04%,无规卷曲占12.69%；三级结构模型显示与该GAD蛋白含有大量的α-螺旋和p-折叠,与二级结构的预测结果相符。保守结构域检测结果显示该序列有GABA-T功能位点,催化位点的氨基酸是赖氨酸（Lys, K）,结合位点由8个氨基酸构成。系统进化树显示该GABA-T与曲霉属（Aspergillus）的GABA-T在进化关系上最为接近.Blastp结果显示其与土曲霉（A.teeeeus,登录号:XP001217977.1）和米曲霉（Aspergillus oryzae,登录号：EIT80762.1）的GABA-T氨基酸序列同源性最高,都为82%。5.GAD和GABA-T基因的表达分析利用qRT-PCR技术检测了不同培养时间下红色红曲霉Mr-5的GAD和GABA-T基因的相对表达情况。通过内参基因actin的转录水平将GAD和GABA-T基因转录的mRNA量进行标准化,并以第一组（10d）为对照进行分析。结果显示,红色红曲霉GAD的mRNA水平随着培养时间的延长而增高,培养16d、19d和22d的相对表达量与对照组差异显著（p<0.05）;GABA-T的相对表达量随着培养时间的延长而降低,在培养时间为19d的时候接近最低值,其他各组与对照组（10d）的差异显著（p<0.05）。6.红色红曲霉Mr-5GAD基因的原核表达将红色红曲霉Mr-5的GAD基因与载体pET-21a（+）连接,转化到E-coli BL21（DE3）中进行诱导表达。SDS-PAGE结果显示,IPTG浓度为1mM,在37℃、28℃、16℃的诱导条件下,重组蛋白主要以包涵体形式表达,且在28℃下表达量最大,其相对分子质量约为58kDa,与预测值相符。重组蛋白经镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE结果表明咪唑浓度为250mM时洗脱效果最好,经纯化后的融合蛋白只有一条蛋白带,Bradford法测得纯化后的蛋白浓度为0.2956mg/mL。