碳酸氢钠和氧化三甲胺（Trimethylamine N-oxide,TMAO）存在于循环血液中,影响了许多疾病的发生和发展,比如高血压和慢性肾脏疾病（Chronic kidney disease,CKD）。有研究表明,1型电中性的钠离子碳酸氢根共转运受体（Electroneutral Na⁺/HCO₃^-cotransporter 1,NBCn1）敲除小鼠的肠系膜动脉由于一氧化氮（Nitric oxide,NO）合成降低,导致其对乙酰胆碱诱导的舒张反应减弱。衰老及CKD小鼠血浆中的TMAO浓度升高导致活性氧（Reactive oxygen species,ROS）过量产生,抑制内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase,e NOS）的活性,抑制NO的释放,最终减弱乙酰胆碱诱导的肠系膜动脉的舒张。肾小球入球动脉是体内最微细的阻力血管,通过血管的收缩和舒张而改变血管的阻力,改变肾单位的血流量和肾小球滤过率,从而影响全身血量,调节血压。那么,NaHCO₃和TMAO是否能通过影响肾小球入球动脉的收缩和舒张来影响其阻力?改变的肾小球入球动脉阻力是否能影响小鼠肾小球滤过滤和血压?如果可以,又是通过何种机制来起作用的?针对这些问题,我们采用国际领先的肾小球入球动脉灌注技术,探究NaHCO₃和TMAO对高血压小鼠肾小球入球动脉的张力以及GFR的影响和机制。为临床治疗CKD以及高血压等相关疾病提供新的思路。第一部分:NaHCO₃调节小鼠肾小球入球动脉张力和肾小球滤过率的机制研究目的:单位时间内两肾生成的超滤液量称为肾小球滤过率（Glomerular filtration rate,GFR）。当肾小球入球动脉收缩,张力升高,血管阻力增加,致使肾小球毛细血管滤过压降低,GFR降低。CKD病人随着病情逐渐加重,其滤过面积和滤过压下降,GFR逐渐降低。糖尿病病人早期因为高渗利尿而出现GFR升高的现象,糖尿病肾病后期GFR下降。改善肾小球入球动脉张力,逆转GFR能对肾脏疾病起到一定的保护作用。口服适量的NaHCO₃能够通过减轻CKD病人代谢性酸中毒,增加肾小球的滤过功能,减缓GFR的下降速率,从而保护肾功能。目前,NaHCO₃的肾功能保护机制尚不清楚。我们假说NaHCO₃通过钠离子碳酸氢根共转运受体（Na⁺/HCO₃^-cotransporters,NBCs）增加碳酸氢根在细胞膜的转运,缓解CKD时的酸中毒,从而扩张肾小球入球动脉,降低入球动脉的阻力,肾血流增加,导致GFR增加,改善肾功能。方法:1.给予C57Bl/6小鼠静脉注射溶解于生理盐水或等浓度的碳酸氢钠溶液（44 m M）的FITC-sinistrin,通过检测FITC-sinistrin的血浆清除率来测定氯化钠或碳酸氢钠对清醒小鼠GFR的影响。通过颈动脉插管或微电极检测碳酸氢钠对血压以及血浆pH的影响。2.在解剖显微镜下解剖出完整的单个肾小球连接着入球动脉,然后转入生理平衡液中,在模拟生理的条件下进行肾入球动脉灌注。血管平衡15分钟后,根据实验目的再给予不同的浴液,检测肾入球动脉直径的变化情况,研究NaHCO₃通过NBCs影响血管张力变化。3.应用RT-PCR、qPCR和免疫荧光等技术方法,检测入球动脉以及原代培养的内皮和平滑肌细胞的细胞膜上碳酸氢根的转运受体的表达。4.应用入球动脉灌注技术和荧光检测pH探针BCECF-AM（2′,7′-bis-（2 Carboxyethyl）-5-（and-6）Carboxyfluorescein,Acetoxymethyl Ester,BCECF-AM）或荧光检测一氧化氮（Nitric oxide,NO）探针DAF-2 DA（4,5-diaminofluorescein diacetate,DAF-2 DA）来检测肾入球动脉血管内pH及NO的变化。结果:1.静脉注射NaHCO₃,小鼠在不影响血压和血浆pH的条件下,GFR增加。碳酸氢钠能舒张入球动脉,而氯化钠对照组未见异常。2.NBCn1和1型生电性的钠离子碳酸氢根共转运受体(Electrogenic Na⁺/HCO₃-cotransporter 1,NBCe1)在入球动脉以及原代培养的肾血管平滑肌和内皮细胞上表达。NBCs抑制剂S0859能抑制碳酸氢钠引起的舒张。3.NaHCO₃显著增加肾入球动脉的血管内pH,该反应能被S0859抑制。增加入球动脉细胞外的pH也能舒张肾入球动脉。4.NaHCO₃以及增加细胞外pH能够显著上调入球动脉NO的水平。内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase,e NOS）抑制剂L-NAME（L-NGNitroarginine Methyl Ester）能抑制入球动脉NO的生成和血管舒张。结论:肾小球入球动脉上表达钠离子碳酸氢根共转运受体NBCe1和NBCn1。碳酸氢根通过NBCs进入肾入球动脉内皮细胞并增加细胞内pH,进而激活e NOS并促进NO的生成,舒张入球动脉,最终增加小鼠GFR。第二部分:TMAO对血管紧张素Ⅱ诱导的高血压病的作用机制研究目的:肠道菌群能影响诸多疾病的发生、发展。TMAO作为肠道菌群的代谢产物,在多种疾病的发展中起着重要作用。TMAO能够导致CKD加重,动脉粥样硬化的发展。然而,TMAO能否和如何影响血流和血压,其具体机制尚不清楚。肾小球入球动脉是人体的主要阻力血管,通过血管的收缩和舒张而改变血管的阻力,调节肾单位的血流量及肾小球滤过率,从而影响全身血量,调节血压。为进一步探索TMAO调节GFR的机制,我们提出假设,TMAO通过影响入球动脉阻力,进而调节小鼠肾血流量和GFR,在高血压病的作用机制起重要作用。方法:1.我们应用肾入球动脉灌注,多通道血管张力测定系统来研究TMAO能否直接收缩入球动脉,影响肠系膜动脉张力。同时检测200μM TMAO处理下,血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）引起的入球动脉收缩程度。同时,应用一些相关ROS及其下游通路蛋白抑制剂,比如,活性氧（Reactive oxygen stress,ROS）抑制剂四甲基哌啶（4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl,Tempol）、钙离子-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（Calcium/calmodulin-dependent kinase Ⅱ,Ca MKⅡ）抑制剂KN-93和磷脂酶C（phospholipase C,PLC）抑制剂U73122来探究TMAO的具体作用机制。应用钙离子荧光探针Fluo-4,AM来检测在TMAO作用下,肾入球动脉释放钙离子的变化和可能的机制。2.应用颈动脉插管检测小鼠急性血压变化,颈静脉注射TMAO,或者合并TMAO和Ang Ⅱ来研究TMAO对小鼠急性血压的影响。3.应用Ang Ⅱ微型缓释泵来构建小鼠高血压模型。给予高血压模型小鼠含1%TMAO的饮水,研究TMAO对小鼠高血压的影响。给予小鼠含抗生素的饮水来抑制TMAO的生成,研究降低TMAO的合成对Ang Ⅱ诱导的高血压病的影响。C57Bl/6小鼠一共分为六组,对照组、TMAO组、Ang Ⅱ组、TMAO+AngⅡ组、抗生素组和抗生素+Ang Ⅱ组。应用尾套法检测小鼠血压随给药时间变化的曲线。应用酶联免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠的血清TMAO和Ang Ⅱ浓度。取出小鼠入球动脉和肠系膜动脉,检测其对Ang Ⅱ等血管收缩剂的反应性的差异。4.离体培养小鼠主动脉平滑肌细胞系（Mouse aortic smooth muscle cells,MOVAS）。不同浓度的TMAO处理MOVAS固定的时间（24小时）或者固定浓度的TMAO（100μM）处理MOVAS不同的时间,Western blot检测相关通路蛋白的表达。应用荧光探针（Mito SOX,DHE,JC-1）,检测氧化应激水平的变化。结果:1.低浓度TMAO（<1 m M）不能直接收缩血管,高浓度TMAO（>2 m M）却可以直接收缩入球和肠系膜动脉。入球动脉比肠系膜动脉对TMAO更敏感。相应的,静脉注射低于30 mg/kg的TMAO不影响小鼠血压,但是,大于100mg/kg的TMAO能升高小鼠血压。2.C57Bl/6小鼠入球动脉体外孵育TMAO增强Ang Ⅱ诱导的血管收缩。Tempol、KN-93、U73122都能抑制TMAO对Ang Ⅱ的作用。相应的,采用静脉注射TMAO、Ang Ⅱ、Tempol和KN-93,观测到类似趋势的急性血压变化。Ang Ⅱ诱发的入球动脉的钙离子的释放被TMAO放大,这种放大作用能被Tempol和U73122抑制。3.给予C57Bl/6小鼠含TMAO的饮水加重Ang Ⅱ引起的血压升高,给予抗生素饮水时,却得到了相反的结果。单独给予TMAO或抗生素饮水不影响小鼠的慢性血压。经检测发现,抗生素饮水能显著降低小鼠体内TMAO浓度,却不影响血清Ang Ⅱ浓度。给予Ang Ⅱ能显著增强血清的TMAO浓度。同时,我们发现给予TMAO的小鼠的肠系膜和入球动脉对Ang Ⅱ的反应性增强,这种增强作用能被U73122抑制。4.MOVAS孵育TMAO导致细胞内ROS爆发,进而激活其下游Ca MKⅡ/PLCβ3/Ca²⁺通路。结论低浓度TMAO对血管张力没有影响,但是高浓度的TMAO却能收缩血管,升高血压。低浓度的TMAO通过激活ROS/Ca MKⅡ/PLCβ3/Ca²⁺显著增强入球动脉对Ang Ⅱ的反应性,并且增加小鼠对Ang Ⅱ的急性升压反应。给予含TMAO的饮水能加重Ang Ⅱ诱导的慢性高血压,抗生素则通过抑制肠道菌群,降低TMAO生成,减轻Ang Ⅱ诱导的慢性高血压。