宫颈癌在全球女性中是第二位常见的恶性肿瘤,且80％在发展中国家。我国每年新发病例约在11万以上,约2～3万妇女死于该病,其发病机理尚不明确。目前HPV感染被公认是引起宫颈癌的必要条件,但不是充分条件。HPV的终身感染率累积可高达60％～70％,但仅2～3％的女性最终发展成为宫颈癌。提示有其他辅助因素共同参与宫颈癌发病病理机制。近年研究发现肿瘤细胞的发生伴有分子和基因的改变,还可能伴有离子通道的变化。因此,对离子通道的研究已引起学者们的高度重视。　　 细胞内钙的调节是细胞增殖的重要信号机制之一。在癌细胞的细胞周期中,DNA合成及有丝分裂同样需要一定的Ca2+浓度用以完成快速增殖过程。T-型钙通道具有独特的激活、失活特性在多种肿瘤组织细胞中表达,且T型钙通道在某些癌细胞中的表达依赖于细胞的增殖状态。应用T-型钙通道阻滞剂及小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰α1亚单位的功能后,细胞的增殖活性下降。因T型钙通道在上皮组织中不表达,故选择性的阻断T型钙通道有望成为阻止肿瘤生长治疗某些肿瘤的有效方式。　　 T-型钙通道在某些肿瘤的发生发展中起重要作用,但它与妇科肿瘤发生的关系以及对妇科肿瘤细胞生物学行为的影响尚未见报道。本课题从研究T-型钙通道在正常子宫颈组织和癌组织中表达入手,利用RNA干扰(RNAi)技术抑制宫颈癌Siha细胞株中T-型钙通道(Cav3.1,Cav3.2)的表达,并运用免疫组化、Real-TimeRT-PCR、流式细胞仪、及该通道的各种阻滞剂,免疫荧光等技术研究T-型钙通道在宫颈癌细胞增殖和细胞周期中的作用及该通道对细胞增殖调节的可能机制。　　 本课题共分三部分:1、T型钙通道在宫颈癌组织细胞中表达；2、T型钙通道对宫颈癌Siha细胞增殖及对细胞周期的影响；3、T型钙通道阻滞剂抑制人宫颈癌Siha细胞裸鼠移植瘤生长的研究。　　 第一部分、T型钙通道在宫颈癌组织中表达目的检测人的正常子宫颈和宫颈癌组织中T型钙通道Cav3.1,Cav3.2的表达,研究它与宫颈癌的关系。　　 方法：应用逆转录聚合酶链反应Real-Time RT-PCR(q-RT-PCR)检测正常宫颈和宫颈癌组织中Cav3.1,Cav3.2 mRNA的表达,免疫组织化学检测正常宫颈和宫颈癌组织中Cav3.1,CaLv3.2通道蛋白的表达。　　 结果：12例正常子宫颈标本组织中10例Cav3.1,Cav3.2mRNA弱表达或不表达仅有2例中等表达;而25例宫颈癌标本组织都表达Cav3.1,Cav3.2mRNA。宫颈癌组织和正常子宫颈组织Cav3.1,Cav3.2mRNA表达差异具有统计学意义(P＜0.01);12例正常子宫颈标本组织中仅有3例弱表达Cav3.1蛋白,4例弱表达Cav3-2蛋白,而25例宫颈癌标本组织都表达Cav3.1,Cav3.2蛋白。宫颈癌组织和正常子宫颈组织Cav3.1,Cav3.2蛋白表达差异具有统计学意义(P＜0.01)。免疫组化和Real-TimePCR结果基本一致。　　 结论：T型钙通道(Cav3.1,Cav3.2)的过表达可能与宫颈癌的发生发展有关。　　 第二部分、T型钙通道对宫颈癌Siha细胞生长及其对细胞周期的影响目的探讨T型钙通道Cav3.1,Cav3.2对宫颈癌细胞生长调节作用及其可能机制。　　 方法：选择高表达T型钙通道Cav3.1,Cav3.2的宫颈癌Siha细胞株作为研究对象。①检测不同浓度、不同种类阻滞剂和siRNA技术对Siha细胞增殖的影响。②针对T型钙通道Cav3.1,Cav3.2设计一对特异性siRNA和一对阴性对照siRNA(scrarnbled-silencing)。用RNAi干扰宫颈癌细胞中Cav3.1,Cav3.2基因的表达,用FAM标记的siRNA检测转染效率和Western blotting检测干扰效率。③采用免疫荧光,流式细胞仪,细胞计数等方法了解特异性抑制Cav3.1,Cav3.2通道的表达和阻滞剂阻断Cav3.1,Cav3.2通道后对Siha细胞增殖和细胞周期的影响。④在特异性抑制T型钙通道Cav3.1,Cav3.2的表达和阻滞剂阻断T型钙通道Cav3.1,Cav3.2条件下,利用免疫荧光,Western blotting技术检测与细胞周期密切相关的CyclinD1,Cyclin E蛋白的表达,初步探讨T型钙通道Cav3.1,Cav3.2调节细胞生长的可能机制。　　 结果：针对T型钙通道Cav3.1/3.2的siRNA抑制了宫颈癌Siha细胞中Cav3.1/3.2通道的表达;siRNA特异并有效地抑制Siha细胞中T型钙通道的表达,使细胞增殖减少(P＜0.01),并使细胞周期阻滞在G0-G1期,S期减少(P＜0.01);特异性阻滞剂NNC55-0396,呈时间依赖的方式抑制Siha细胞的增殖;NNC55-0396,mibefradil呈剂量依赖的方式抑制Siha细胞的增殖;NNC55-0396,mibefradil呈剂量依赖的方式使细胞周期阻滞于G0-G1期,S期减少;特异性抑制T型钙通道Cav3.1/3.2的表达和阻滞剂阻断T型钙通道后,细胞周期蛋白Cyclin D1,Cyclin E表达下调。　　 结论：①T型钙通道Cav3.1,Cav3.2在宫颈癌Siha细胞中功能性表达。②T型钙通道Cav3.1,Cav3.2参与细胞增殖和细胞周期的调节,其可能机制是调节Cyclin D1,Cyclin E蛋白的表达水平,使细胞通过G0-G1期进入S期,也有可能通过其它机制调节细胞的增殖和细胞周期,T型钙通道Cav3.1,Cav3.2可作为宫颈癌组织恶性转化的标志物和宫颈癌放化疗的靶点。　　 第三部分、T型钙通道阻滞剂抑制人宫颈癌Siha细胞裸鼠移植瘤生长的研究目的进一步探讨T型钙通道Cav3.1,Cav3.2在宫颈癌发生发展中的作用。　　 方法：该试验用18只BAL B/c裸鼠,随机分为研究组和对照组,每组9只。两组裸鼠均皮下注射Siha细胞5×106/只,治疗组加入T型钙通道阻滞剂NNC55-0396,使其最终浓度为20μM,对照组加入相同体积的DMEM无血清培养液(用来溶解NNC55-0396,为0.3ml)。观察裸鼠的一般情况,每七天测量肿瘤的体积,在第21天处死裸鼠,测量肿瘤的体积和重量。　　 结果：两组裸鼠一般情况无差异性变化;在接种第7、14、21天,对照组和治疗组肿瘤体积为(meana±SD;mm3):189.3±26.7 versus146.3±22.9(P＜0.01);327.8±76.0versus203.5±43.5(P＜0.01);803.7±187.2 versus348.8±127.0(P＜0.01);对照组和治疗组肿瘤重量为0.74±0.25g versus0.40±0.07g(P＜0.01)。　　 结论：T型钙通道Cav3.1,Car3.2在宫颈癌发生发展中发挥重要的作用,可能成为治疗宫颈癌的新靶点。　　 小结：T型钙通道在宫颈癌组织中过度表达,调节宫颈癌细胞的增殖和细胞周期。本研究还研究了T型钙通道Cav3.1,Cav3.2在宫颈癌Siha细胞株中的特性,初步探讨了T型钙通道Cav3.1,Cav3.2调节宫颈癌细胞增殖和细胞周期的可能机制,为进一步研究宫颈癌的发生发展提供了新的思路。本研究中RNAi技术的应用,为难治性和复发性宫颈癌的基因治疗提供了新策略。