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研究背景糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)已成为终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的首要原因。既往认为 DKD 早期主要病变部位在肾小球,而肾小管间质纤维化是DKD发展到后期的病理学特征。然而,近年来的研究发现肾小管间质损害程度成为反映肾功能下降严重程度和判断预后最重要的指标,而肾小管上皮细胞转分化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)则是肾小管间质纤维化的关键环节。Klotho是一种抗衰老因子,早期DKD患者血清Klotho水平已出现明显的下降,是DKD较早出现的生物标志物之一。Klotho可通过抑制TGF-β1/Smad3、ERK1/2信号通路,延缓DKD进展。早期生长反应蛋白-l(Early growth response protein 1,Egr-1),是一种具有锌指结构的转录因子,可通过与TGF-β1、ERK1/2形成正反馈环路促进肾脏纤维化。并且,已有研究表明,TGF-β1可通过激活ERK1/2信号通路促进肾脏纤维化。目前关于Klotho与Egr-1在DKD发病中是否有相互作用及作用机制的研究未见报道。本研究旨在探索Klotho和Egr-1在DKD肾小管上皮细胞转分化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)中发挥的作用,阐明在 DKD 进展中Klotho是否通过抑制TGF-β1/Smad3-ERK1/2信号下调Egr-1发挥抗肾脏纤维化作用,为深入理解DKD发病的分子机制和寻找新的治疗靶点提供理论基础。方法1动物实验用HFD/STZ诱导C57BL/6J小鼠(n=12)制造糖尿病模型,同系正常小鼠(n=12)作为对照。成模后分别于6w、12w时留取血、尿行生化指标检测,处死后取肾脏组织冻存于-80℃冰箱,或用4%多聚甲醛固定。PAS、Masson染色法观察肾组织的形态结构变化,免疫组化法分析肾皮质中Klotho和Egr-1表达的变化。2细胞培养人肾小管上皮细胞株(HK2)购买于上海中国科学院细胞库,于含1.0g/L糖的DMEM培养基+10%FBS中培养,在37℃、5%CO2培养箱中孵育。每2-3天传代一次。3细胞转染转染前一天,细胞接种于12孔板中,转染时要求细胞密度达到60%或80%。使用lipo3000进行瞬时转染siRNA或质粒,siRNA转染浓度为50nM,质粒转染浓度为1ug/ml。4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)Trizol法提取组织及细胞总RNA。M-MLV逆转录酶试剂将RNA逆转录为cDNA。SYBR法进行实时荧光定量PCR反应,β-actin为内参,目的基因表达量按2-△△ct方法计算得出。5 Western BlotRIPA法提取组织及细胞总蛋白。配制10%的SDS-PAGE胶,每孔上样量为20ug。电泳分离样品蛋白,湿转到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉或5%BSA封闭PVDF膜,一抗孵育PVDF膜,4℃摇床过夜。荧光二抗孵lh,TBST洗涤。在Odyssey近红外成像系统发光显影,Gel-Pro analyzer分析结果。6统计分析各指标数据采用均数±标准差(X±SD)表示,多组数据比较采用单因素方差分析,正态分布两样本比较采用两独立样本t检验,P<0.05时被认为差异具有统计学意义。结果1 Klotho与Egr-1在HFD/STZ诱导的DM小鼠肾皮质中表达水平的变化研究(1)与对照组相比,DM组小鼠血清Klotho水平6w时已明显降低,12w进一降低,24h尿微量白蛋白水平6w时已明显升高,12w时进一步升高。(2)与对照组相比,DM组小鼠肾皮质中Klotho表达水平6w时已明显降低,12w时进一步降低,Egr-1表达水平到12w时才出现明显升高。2 Klotho在DKD进展中对肾小管EMT的作用研究(1)HK2细胞中Klotho的表达水平在HG、TGF-β1刺激后12h出现明显下降,24h进一步降低。(2)与 pcDNA-Vector 相比,瞬时转染 pcDNA-Klotho 可抑制 HG、TGF-β1诱导的HK2细胞中E-cadherin表达降低、α-SMA及FN表达升高。(3)与si-Negative相比,瞬时转染si-Klotho可使HG、TGF-[β1诱导的HK2细胞中E-cadherin表达进一步降低、α-SMA及FN表达进一步升高。3 Egr-1在DKD进展中对肾小管EMT的作用研究(1)HK2细胞中Egr-1的表达在HG、TGF-β1刺激后0.5h出现明显的升高,6h回落到基线水平。(2)与si-Negative相比,瞬时转染si-Egr-1可减弱HG、TGF-β1诱导的HK2细胞中E-cadherin表达降低、α-SMA及FN表达升高。(3)与 pENTER-Vector 相比,瞬时转染 pENTER-Egr-1 可使 HG、TGF-βl诱导的HK2细胞中E-cadherin表达进一步降低、α-SMA及FN表达进一步升高。4 Klotho在DKD进展中下调Egr-1的机制研究(1)与 pcDNA-Vector 相比,瞬时转染 pcDNA-Klotho 可抑制 HG、TGF-βl 诱导的 HK2 细胞中 Egr-1 表达升高、p-Smad3/Smad3 及(p-ERKl/2)/(ERK1/2)蛋白比值升高。(2)与si-Negative相比,瞬时转染si-Klotho可使HG、TGF-βl诱导的HK2 细胞中 Egr-1 表达进一步升高,p-Smad3/Smad3 及(p-ERKl/2)/(ERKl/2)蛋白比值进一步升高,si-Klotho的上述作用可被ERK1/2抑制剂PD98059明显减弱。结论l早期DKD小鼠肾皮质中Klotho表达明显减少,Egr-1表达明显增加,且Klotho表达水平的降低早期Egr-1表达水平的升高。2 HG、TGF-βl对HK2细胞中Klotho表达的抑制作用呈时间依赖性,Klotoh在DKD进展中对肾小管EMT具有抑制作用。3 HG、TGF-β1可诱导HK2细胞中Egr-1瞬时表达,Egr-1在DKD进展中对肾小管EMT具有促进作用。4 Klotho 通过抑制 TGF-β1/Smad3-ERKl/2 信号通路下调 HG、TGF-βl 诱导的HK2中Egr-1的表达,这可能是Klotho在DKD进展中抗肾脏纤维化的重要机制之一。