论文部分内容阅读
背景及目的：结直肠癌在发达国家发病率居恶性肿瘤第三位,死亡率更居第二位。在我国结直肠癌发病率居第三位且呈上升趋势,死亡率则居第五位,复发、转移或死亡率近50%。实体瘤的生长和转移依赖于肿瘤内新生血管的形成,为其提供氧及营养物质。抗肿瘤血管生成治疗是结肠癌研究领域关注的焦点。化疗在提高临床疗效方面已近瓶颈,而联合抗肿瘤血管生成治疗大大提高了疗效。目前抗肿瘤血管生成治疗局限于干扰内皮细胞的功能和干扰肿瘤血管发育的微环境两方面,肿瘤干细胞能够向血管内皮细胞分化是目前抗肿瘤血管生成治疗失败的主要原因之一。肿瘤干细胞能不能向血管内皮细胞分化一直是干细胞研究领域讨论的热点。长期以来的研究发现肿瘤组织中的内皮细胞和正常组织中的内皮细胞的基因表达具有明显差别,进而产生了血管生成模拟即肿瘤细胞充当血管内皮细胞的角色排列成肿瘤的脉管的观点,但这些肿瘤细胞在来源上不能确定,一般认为肿瘤细胞在接近新生脉管的微环境下会获得内皮细胞的特性,而有一研究提出肿瘤干细胞可能完成血管模拟功能。最近研究发现在胶质瘤中,肿瘤干样细胞能向内皮细胞分化同宿主内皮细胞一起参与了肿瘤血管的形成。肿瘤干细胞首先在血液系统肿瘤中被报道,往往它们含量非常稀少,但在肿瘤组织内它们具有无限增殖能力和强成瘤能力。《Nature》在2007年一月份连续发表了两项研究,报道CD133+细胞是结肠癌的来源,这些细胞是一小群未分化的、占全部肿瘤组织细胞的2.5%左右,但在无血清条件培养基中能以未分化的克隆细胞球(简称克隆球)形态呈对数增长超过1年的时间并保持成瘤性。Matilde Todaro等进一步证明了结肠癌CD133+亚群富含干细胞。Pim-1基因是一种原癌基因,被发现于1980s。Pim-1在胚胎期高表达,成人后关闭。它位于6p21.1-p21.31,编码丝／苏氨酸激酶(pim-1激酶)。Pim-1的生理功能主要体现在他是B淋巴细胞生成、增殖活化的重要调控蛋白；病理功能方面Pim-1激酶具有潜在的成瘤性而高表达于血液病及实体瘤中。目前对它的成瘤性研究主要围绕着和MYC相关的抗凋亡研究,它调节前列腺癌等细胞的增殖、分化、抗凋亡等生物学活性,在缺氧条件下,Pim-1能促进胰腺癌细胞成瘤并介导缺氧相关的耐药,逐渐成为肿瘤学研究的热点之一。关于结肠癌干细胞向血管内皮细胞分化的机制,通过进一步文献检索,发现Pim-1是胚胎干细胞向血管内皮细胞和周细胞分化并形成血管过程中必需的激酶,pim-1能不能介导肿瘤干细胞向血管内皮细胞分化,这个问题引起了我们的注意。我们前期研究发现,pim-1高表达于CD133+亚群,CD133-亚群基本不表达。我们推测结肠癌的预后是由肿瘤组织的不同部位(癌、癌间质、癌旁粘膜)pim-1的表达共同决定的；pim-1可能是晚期肿瘤化疗疗效的预测因子；pim-1可能是介导结肠癌干细胞向血管内皮细胞分化的关键蛋白之一。本课题拟回顾性分析pim-1对结肠癌的预后影响,并进一步分析晚期结肠癌患者的pim-1的表达水平和肿瘤血管密度及患者一线含奥沙利铂和5-FU方案化疗的疗效之间的关系；并在体内、外观察pim-1对结肠癌CD133+亚群向血管内皮细胞分化的影响,验证干预肿瘤干细胞向内皮细胞分化将是未来抗肿瘤血管生成治疗的一个新方向,进一步丰富抗肿瘤血管生成治疗的基础理论。方法：1.回顾性分析pim-1在结肠癌不同部位(癌组织、癌旁粘膜、癌间质)的表达与患者DFS和OS之间的关系,探讨结肠癌的预后指标；观察记录复发／转移的结肠癌患者一线含奥沙利铂和5-FU方案化疗的疗效,将其肿瘤标本建立组织芯片,利用连续切片免疫组化观察pim-1的表达和肿瘤血管密度之间的关系,进一步统计pim-1的表达情况与患者化疗疗效之间的关系；2.通过流式分选出CD133+、CD133-亚群,在含VEGFA的EBM-2培养基中进行血管内皮分化诱导,从细胞表型、细胞功能、特异性的组织形态学结构、血管网格形成实验,对CD133+亚群能够向血管内皮细胞分化进行鉴定；3.构建携RFP的pim-1过表达和干扰慢病毒载体及相应的对照载体,感染结肠癌细胞HT29、LOVO、HCT116后,在体外通过含VEGFA的EBM-2培养基中进行血管内皮分化诱导,通过RT-PCR、Western blot观察不同组别之间血管内皮细胞表型标志蛋白之间的差别；血管网格形成能力的差别；4.将上述转染的结肠癌细胞进行流式分选,分别分选出CD133+RFP+的细胞亚群,构建裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤后在处死前5分钟尾静脉注射FITC-UEA,切片后标记CD31,激光共聚焦显微镜下比较RFP对照组、pim-1过表达组、pim-1干扰组在体内形成血管的能力及灌注功能。结果：1.为探讨pim-1对结肠癌的预后,我们对接受根治性切除的343例结肠癌患者术后肿瘤标本通过免疫组化的方法检测pim-1的表达,回顾性分析它与DFS和OS之间的关系：利用多变量Cox比例风险模型确定结肠癌的独立预后因子,采用层次分析法计算癌组织、癌间质、癌旁粘膜的pim-1对预后的权重0.1132686,0.5076026,0.3791288,建立pim-1总评分(PTS)公式：PTS=0.1132686p1+0.5076026p2+(-)0.3791288p3(pl、p2、p3分别代表癌、癌旁粘膜、癌间质的pim-1表达的病理评分),利用Delphi Method进行分为3级：低PTS≤0,中0<PTS≤0.5,高PTS>0.5；然后进行log-rank生存分析,发现结肠癌患者的预后(DFS/OS)是由癌组织、癌间质、癌旁粘膜的pim-1共同决定的,提示癌旁粘膜的癌变程度、癌间质免疫细胞的活化程度、癌本身的恶性程度(即它们pim-1表达的高低)共同决定了肿瘤患者的预后；肿瘤组织的pim-1表达水平和肿瘤血管密度成正相关；是晚期结肠患者一线含奥沙利铂和5-FU方案化疗疗效差重要的预测指标。2.我们通过流式分选的方法获取了CD133+结肠癌,通过成球、克隆形成、成瘤实验对其干性进行鉴定,证明CD133+结肠癌细胞亚群富含结肠癌干样细胞；将CD133+亚群细胞在EBM-2(内皮细胞基础培养基)中进诱导,通过内皮细胞表型鉴定、功能鉴定(Dii-AcLDL内吞和FITC-UEA结合实验)、组织形态学鉴定、成管实验鉴定,发现：CD133+亚群能够分化成具有内皮细胞表型(CD144、VEGFR2、CD31、CD105)的细胞；能够分化成内吞Dii-AcLDL和FITC-UEA结合具有内皮细胞独特功能的细胞；能够分化成空泡状具有内皮细胞独特组织形态学的细胞；分化的的细胞能够向血管内皮细胞一样具有成管功能。上述鉴定证明：富含结肠癌干样细胞的CD133+亚群能够分化成血管内皮细胞,参与肿瘤血管的生成。3.为了进一步验证pim-1在CD133+亚群向血管内皮细胞分化中的作用,我们首先对CD133+亚群和CD133-亚群中的pim-1进行检测,发现pim-1高表达于CD133+亚群。我们进一步对五株结肠癌细胞系进行了pim-1表达情况筛查,发现LOVO表达最低、HCT116表达最高。通过构建pim-1过表达慢病毒载体转染LOVO细胞,建立pim-1过表达的稳定株；构建pim-1干扰慢病毒载体转染HCT116细胞,建立pim-1干扰的稳定株；进一步通过流式分选CD133+亚群在EBM-2中进诱导,分别从血管内皮细胞表型的标记物、成管能力、裸鼠体内接种后的血管密度及灌注功能进行检测,发现LOVO细胞过表达pim-1能显著增加CD144、VEGFR2、CD31、CD105具有内皮细胞表型标记物的表达,能够增强其成管能力,接种后的移植瘤血管密度显著增加,灌注功能显著下降；HCT116细胞阻断pim-1表达能显著降低CD144、VEGFR2、 CD31、CD105具有内皮细胞表型标记物的表达,能够阻断其成管能力,接种后的移植瘤血管密度显著降低,灌注功能明显改善；上述实验证明了过表达pim-1能够增强结肠癌干样细胞向血管内皮细胞分化的能力；干扰pim-1的表达能够抑制结肠癌干样细胞向血管内皮细胞分化的能力。结论：1. pim-1既是结肠癌患者独立的预后因子,也是晚期结肠癌患者化疗疗效的预测因子。2. CD133+结肠癌干样细胞有向肿瘤血管内皮细胞分化的潜能。3. pim-1是结肠癌干样细胞向血管内皮细胞分化过程中的重要调控蛋白。