自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK cells)因其天然的杀伤能力而得名。从1975年的偶然发现到如今被免疫学家和临床医生寄予厚望,学界对NK细胞的认识经历了从最早CD56+CD3-简单表型描述到鉴定NK细胞是机体抗病毒和抗肿瘤的天然淋巴细胞重要亚群之一的漫长过程。NK细胞不仅是宿主防御中的“哨兵”,而且可以通过分泌细胞因子和趋化因子在维持组织稳态中发挥关键作用。体内成熟NK细胞数量的异常对肿瘤的发生发展,甚至是对自身免疫疾病发生都有重要影响。但是,目前无论是NK细胞功能分子的研究,还是促进NK细胞发育成熟调控因子的研究,仍主要局限于IFN-γ和IL-15等少数细胞因子。生长促进因子作为一类广泛表达且对于细胞发育成熟非常作用的细胞因子,在NK细胞的研究中鲜有报道。同时,NK细胞功能的研究仍主要集中于外周NK细胞在宿主防御中的作用,但是关于组织居留NK(Tissue-Resident NK,trNK)细胞的组织特异性功能报道甚少。人外周血中,NK细胞约占淋巴细胞总数的10%。但是在子宫组织中,随着妊娠反应的开始,子宫内膜迅速蜕膜化,NK细胞数量迅速增加,最高可达蜕膜组织淋巴细胞总数的70%。蜕膜组织NK细胞数量和最佳功能状态对于女性正常妊娠和胎儿健康具有重要意义。蜕膜组织中CD56+CD3-NK细胞一般认为包含少量仍然保留杀伤能力的外周CD11b+NK细胞和少量产生IFN-γ抑制Th17细胞维持母胎免疫耐受的CD27+ NK细胞,但是其中约占蜕膜NK细胞总量80%的CD1 1b-CD27-NK细胞的功能及其作用机制仍然未知。另一方面,NK细胞发育和成熟的研究不仅可以增强我们对体内成熟NK细胞库形成和维持机制的认识,而且更有助于我们在体外分化扩增具有最佳功能状态的成熟NK细胞。一般认为骨髓是NK细胞最主要的发育和成熟场所。NK细胞由存在于骨髓中的造血干细胞通过程序化的发育分化路径,历经淋巴共有前体细胞、NK细胞前体、不成熟NK细胞最终形成成熟的NK细胞迁出骨髓进入外周行使功能。NK细胞在骨髓中的发育和成熟依赖骨髓微环境,其中来源于微环境的细胞因子IL-15 目前被认为是促进NK细胞发育和成熟的重要因素,但是对于NK细胞自身的影响因素以及生长促进因子对NK细胞发育和成熟的关键作用机制知之甚少。本文主要从探究生长促进因子在NK细胞组织特异性功能和促进NK细胞发育和成熟过程中的作用机制和转录调控机制方面展开研究,获得如下结果:Ⅰ、NK细胞产生生长促进因子促进胚胎发育本研究通过高通量基因芯片差异分析子宫trNK细胞和外周血NK细胞,筛选鉴定子宫trNK细胞组织特异性功能分子。通过荧光定量PCR、免疫荧光和流式内标技术检测分析子宫trNK细胞产生生长促进因子(Growth-promoting factors,GPFs)的能力,包括多效生长因子(Pleiotrophin,PTN)、骨生成诱导因子(Osteoglycin,OGN)和骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)。通过绒毛外滋养层细胞与子宫trNK细胞共培养体系研究子宫trNK细胞产生GPFs的调控机制。最后通过检测临床反复流产病人的子宫trNK细胞分泌GPFs能力确定其与胚胎早期发育相关性,进一步通过Ptn-/-Ogn-/-Sppl-/-小鼠确认子宫trNK细胞分泌生长促进因子促进胚胎早期发育的重要生理意义。通过上述研究方案取得了如下结果:1.基因芯片差异分析子宫trNK细胞和外周血NK细胞差异分析子宫trNK细胞和外周血NK细胞的基因芯片数据,结果显示子宫trNK细胞与外周血NK细胞功能分子存在显著差异,子宫trNK细胞特异性高表达PTN、OGN和OPN等对胚胎早期发育非常重要的生长促进因子。2.子宫trNK细胞分泌生长促进因子PTN,OGN和OPN定量PCR、免疫荧光、流式内标检测结果均验证基因芯片结果,子宫trNK细胞相较于外周血NK细胞特异性产生生长促进因子PTN、OGN和OPN。3.HLA-G诱导NK细胞分泌生长促进因子建立绒毛外滋养层细胞与子宫trNK细胞共培养体系模拟体内子宫trNK细胞微环境,结果显示绒毛外滋养层细胞可以促进子宫trNK细胞产生生长促进因子。细胞干扰和抗体阻断实验及721.221-HLA-G细胞系共培养实验结果均提示,绒毛外滋养层细胞过表达的HLA-G分子可以促进子宫trNK细胞产生生长促进因子。4.反复流产病人NK细胞分泌生长促进因子能力显著降低分析反复流产病人子宫trNK细胞,结果显示病人该细胞数量以及产生生长促进因子能力相较正常人均显著减少。该结果提示,子宫trNK细胞产生生长促进因子能力与正产妊娠密切相关。进一步研究发现发育异常的胚胎相较于正常发育胚胎的HLA-G分子表达显著降低。5.Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎发育受限分析Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎发育情况,结果显示生长促进因子联合缺陷小鼠子宫trNK细胞产生生长促进因子能力缺陷后,孕鼠胚胎发育受限,体重、体长值均显著降低。该结果提示子宫trNK细胞可以产生PTN、OGN等生长促进因子促进胚胎早期发育。综上所述,该研究通过人转录组基因芯片,比较了子宫NK细胞和外周血NK细胞的功能基因差异,发现早期妊娠中CD11b-CD27-子宫NK细胞高表达PTN、OGN等对胚胎早期发育非常重要的生长促进因子。胚胎来源的绒毛外滋养层细胞表达的HLA-G与子宫trNK细胞相互作用,诱导NK细胞大量表达生长促进因子,促进胚胎发育。反复流产病人中子宫trNK细胞表达生长促进因子的能力显著下降,不能支持胚胎早期的正常发育。该研究不仅丰富了 NK细胞的功能,而且为临床治疗胚胎生长受限和反复流产等相关疾病提供新的思路。Ⅱ、PBX1通过调控生长促进因子转录促进NK细胞在骨髓发育成熟本研究从NK细胞进化中关键分子保守性的角度筛选鉴定调控NK细胞发育和成熟的关键转录因子PBX1,并且通过定量PCR,Western blotting,流式内标技术方法检测分析人NK细胞体外分化扩增体系不同时间点的细胞和骨髓NK细胞的关键转录因子PBX1和其潜在靶基因生长促进因子PTN和OGN的表达情况。为了研究关键转录因子PBX1的调控机制,通过电核转技术构建NK细胞基因干扰体系,以及通过慢病毒感染构建NK细胞体外分化扩增过程中基因过表达体系,验证PBX1与生长促进因子的潜在调控相关性。为了进一步研究PBX1调控PTN和OGN的作用机制,利用NK细胞CH1P-Seq技术,荧光素酶报告体系和DNA-pulldown体系确认PBX1转录调控PTN和OGN的机制。接下来为了鉴定PBX1对NK细胞发育和成熟的调控作用,通过构建小鼠骨髓嵌合体模型及条件型Pbx1敲除小鼠模型检测分析NK细胞的发育和成熟情况。最后构建Ptn-/-Ogn-/-小鼠模型验证PBX1-PTN/OGN轴对NK细胞发育和成熟的关键作用机制。本研究通过上述研究方案取得了如下结果:1.PBX1是NK细胞高度保守的转录因子分析NK细胞关键分子基因在不同物种中的保守性,发现PBX1是NK细胞高度保守的转录因子。多种实验技术检测结果显示,人骨髓NK细胞相对T细胞特异性高表达PBX1,而且PBX1在NK细胞发育早期和成熟期均有较高表达。2.PBX1调控NK细胞表达PTN和OG]V生物信息学预测分析结果显示,PTN和OGN基因启动子区富含多个转录因子PBX1结合位点。NK细胞干扰和过表达PBX1基因后,流式内标检测生长促进因子PTN和OGN结果显示,在NK细胞中PBX1上调生长促进因子PTN和OGN的表达。为了进一步研究PBX1调控机制,在NK细胞中用抗PBX1抗体富集DNA序列的CHIP-Seq分析结果显示在PTN和OGN基因启动子区中分别存在转录因子PBX1的特异性结合峰。PTN和OGN和基因启动子区的荧光素酶报告实验结果和特异性序列的DNA-pulldown实验结果均验证PBX1可以识别特异性序列,并直接结合PTN和OGN基因启动子区。3.Pbx1缺陷小鼠NK细胞数量严重减少对比分析小鼠骨髓嵌合体模型中Pbx1基因被干扰的骨髓细胞和未被干扰的骨髓细胞中NK细胞的比例和数量,结果显示干扰Pbx1基因表达显著降低骨髓NK细胞和外周NK细胞的比例和数量。分析Pbx1条件型缺陷小鼠,Vav1-Cre小鼠介导的造血前体期Pbx1条件型缺陷严重影响NK细胞的发育,导致小鼠骨髓NK细胞和外周NK细胞的比例和数量显著下降,与骨髓嵌合体小鼠模型结果一致。Ncr1-Cre小鼠介导的NK细胞成熟期Pbx1条件型缺陷同样显著减少成熟NK细胞在骨髓和外周的比例和数量。该结果提示,PBX1不仅可以调控NK细胞的早期发育而且对于NK细胞的成熟具有关键调控作用。4.PBX1促进骨髓NK细胞末端成熟进一步分析发现Vav1-Cre小鼠和Ncr1-Cre小鼠介导的Pbx1条件型缺陷均可以导致小鼠骨髓CD11b+单阳性NK细胞的比例和数量显著减少,从而导致外周CD11b+单阳性NK细胞同样比例和数量显著减少。重组表达的生长促进因子PTN和OGN体内和体外恢复实验结果显示,补充的PTN和OGN可以恢复条件型Pbx1缺陷小鼠CD1 1b+ NK细胞的比例和数量。该结果提示,PBX1通过上调PTN和OGN促进NK细胞自身的末端成熟。5.PBX1-PTN/OGN轴参与NK细胞库的维持分析Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周CD11b+单阳性NK细胞的比例和数量,发现与Pbx1条件型缺陷小鼠结果一致,细胞的比例和数量均显著减少。分析小鼠骨髓NK细胞生长促进因子受体的表达,结果显示小鼠骨髓CD11b+单阳性NK细胞高表达PTN受体RPTP-β。野生小鼠骨髓细胞和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓细胞混合转输实验结果显示,少量的野生型小鼠骨髓细胞即可恢复Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周中成熟NK细胞的比例和数量。重组表达的PTN和OGN体内恢复实验结果也显示,补充PTN和OGN可以恢复Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周成熟NK细胞的比例和数量。该结果提示PBX1通过促进PTN/OGN自分泌支持NK细胞在骨髓的发育和成熟,即PBX1-PTN/OGN轴参与体内成熟NK细胞库的形成和维持。6.PBX1-PTN/OGN 轴上调 T-bet 表达分析Pbx1条件型缺陷小鼠和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓NK细胞增殖和存活以及迁出骨髓的能力,结果显示PBX1-PTN/OGN轴可以促进骨髓NK细胞的增殖和迁出骨髓的能力,但不影响NK细胞存活。T-bet作为控制NK细胞末端成熟和迁出骨髓能力的重要检查点转录因子,T-bet表达检测结果显示在条件型Pbx1缺陷小鼠和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓NK细胞中T-bet表达显著降低,重组表达的PTN和OGN可以显著恢复缺陷小鼠骨髓NK细胞T-bet的表达。该结果提示,PBX1-PTN/OGN轴通过上调T-bet表达促进NK细胞在骨髓的成熟。综上所述,本研究鉴定PBX1是NK细胞高度保守的转录因子。在NK细胞中PBX1可以直接分别结合生长促进因子PTN和OGN启动子区调控其转录。PBX1-PTN/OGN轴上调T-bet表达促进骨髓NK细胞终末成熟,参与体内成熟NK细胞库的形成和维持。该研究不仅对于深入理解NK细胞的发育和成熟具有重要意义,而且对于进一步完善基于NK细胞过继转输的免疫治疗方案也有深远影响。