论文部分内容阅读
金属铅由于其特殊的物理化学性质在工业上被广泛使用,随后沉积在环境中。但是,对于生物体来说,铅并不是机体所需要的元素,反而会机体带来很大危害,能够引起神经、血液、胃肠道、生殖系统、循环系统、免疫系统等的毒性。不过,铅消化毒性机理研究还不多见。在本课题组首次发现高浓度铅抑制斑马鱼(Danio rerio)胰蛋白酶原基因ela2L表达的基础上,本研究利用0.1、0.2和0.3g/L的Pb(NO3)2处理斑马鱼胚胎,real-timePCR和胚胎整体原位杂交结果均显示,铅处理均使斑马鱼胰蛋白酶原基因的表达下调。邻联茴香胺染色实验表明0.2g/L Pb(NO3)2使斑马鱼胚胎中血红素水平降低,RT-PCR和real-time PCR实验证实这个降低具有双重性,0.2g/LPb(NO3)2一方面使血红素合成过程中部分酶的基因表达水平降低,另一方面使控制血红素降解的ho-1表达升高,既抑制了血红素的合成又促进其降解。最近,已有研究证实血红素对斑马鱼胰蛋白酶原基因的调节是通过Bach1b/Nrf2a-MafK路径实现的。由此,我们有理由相信,铅可使血红素水平降低,再通过血红素-Bach/Nrf-Maf路径抑制胰蛋白酶原基因的表达。然而本实验用不同浓度的Pb (N03) 2处理后,利用血红素类似物hemin处理斑马鱼胚胎。Real-time PCR结果显示：hemin并不能显著恢复由铅所引起的胰蛋白酶原基因表达下调,暗示可能存在其他铅损伤途经。Bach (BTB and CNC homology 1, basic leucine zipper transcription factor)基因是碱性亮氨酸家族的一员,是一种转录抑制子,在氧化应激中发挥重要作用。Nrf(Nuclear factor erythroid 2/p45-related factor)是CNC碱性亮氨酸拉链蛋白家族的一员,在调节脊椎动物抗氧化基因和Ⅱ相代谢方面发挥重要作用。当我们用不同浓度的Pb(NO3)2处理斑马鱼胚胎来检测Bach/Nrf因子的转录变化时,结果显示,bachla的表达上调,而nrfla、nrflb、nrf2a、nr/2b和nrf3表达均下调,maf表达也出现异常,这表明铅抑制胰蛋白酶原基因表达也可能直接通过Bach/Nrf-Maf路径实现的。bach1和bach2是bach基因是在许多物种中的旁系同源物,而本实验组最近通过序列查找和比对发现在斑马鱼、青鳉、吉富罗非鱼、红鳍东方鲀和剑尾鱼中bach1包括bach1a和bach1b两个同源基因,斑马鱼、青鳉和吉富罗非鱼中bach2包括bach2a和bach2b两个同源基因。本研究获得bachla、bachlb、bach2a和bach2b的开放阅读框分别为2031、1899、2286和2472bp,分别编码676、632、761和823个氨基酸。进化树分析鱼类的Bach蛋白序列,显示Bach蛋白的两个功能域BTB和BZIP/BRLZ在物种间的高度保守,其分子进化与其物种系统发生基本一致。胚胎整体原位杂交和RT-PCR显示,bachla、bachlb、bach2a和bach2b均从1eell开始表达,为母源表达基因。并且在斑马鱼中全身表达,只是bachlb在血液循环和神经节处有特异性表达。引人注意的是bachla、bachlb、bach2a和bach2b旁系同源基因对铅的抗逆反应有很大差异,其中bachla显著上调,bachlb无显著差异,bach2a和bach2b显著下调。表明bachl和bach2的旁系同源基因都有活性,并已功能歧化。