原发性肝癌(简称肝癌)位居全球恶性肿瘤发病率的第6位,新发肝癌病例中55%发生于中国,其年死亡率占我国各种癌症死亡率的第2位,是我国最常见的消化道肿瘤之一。常用的肝癌非手术治疗方法有:肝动脉栓塞化疗、瘤内无水酒精注射、射频消融等,疗效均不理想。放疗是恶性肿瘤治疗的三大手段之一,随着三维适形放疗和调强放疗技术的发展,放疗在肝癌治疗中的地位被再次提出,近来大量临床研究证实三维适形放疗能显著提高肝癌患者的中位生存期和生活质量。目前,可以肯定的讲原发性肝癌属于放疗敏感肿瘤,放疗已成为肝癌治疗的有力武器。辐射敏感性是影响肿瘤放疗效果的重要因素之一。为了增加辐射敏感性、提高肿瘤放疗疗效,人们试图从基因层面寻找对辐射敏感的基因。如果该基因在辐射之后出现表达变化,且这种表达变化能够促进肿瘤细胞凋亡或抑制肿瘤细胞生长,那么该基因对肿瘤放疗就很有意义,由此制定的放疗方案就有可能很好地提高肿瘤的放疗效果。基于此我们采用基因芯片技术筛选出辐射可诱导表达的基因,研究发现包括IER5基因(Immediate Early Response 5)等30个基因在辐射后出现了mRNA表达上调。IER5基因属于早期慢反应基因家族,本课题组的前期研究发现IER5基因存在于一些肿瘤与正常组织中,可能与细胞周期和细胞凋亡有关。经检索国内外文献获悉,目前人们对IER5基因研究不是很多,尚缺乏有关辐射对在体HepG2细胞IER5基因表达影响的研究报道,对于IER5基因表达调控机制的研究尚为空白。基于此本课题选择mRNA、蛋白表达、细胞凋亡等实验参数,对辐射诱导接种人肝癌HepG2细胞的裸鼠肿瘤组织IER5基因及蛋白表达的影响及辐射诱导该基因表达的启动子区域进行了探索。目的:本课题选择在体HepG2肿瘤细胞作为研究对象,采用Real-time PCR、Western blot、TUNEL染色等实验方法研究IER5基因的辐射效应;采用双荧光素酶报告基因技术初步研究IER5基因辐射应答的启动子区域。方法:1将离体培养的人肝癌HepG2细胞接种在BALB/c-nu裸鼠皮下,待肿瘤块生长至约1.0cm×1.0cm时,让裸鼠接受γ射线照射,辐射剂量分别为2Gy和4Gy。分别在辐射后4h和12h时按实验要求取出瘤体,采用Real-time PCR实验检测辐射后接种人肝癌HepG2细胞的裸鼠肿瘤组织IER5基因mRNA表达的变化;并在辐射后12h采用Western blot和TUNEL染色等实验方法,对肿瘤组织IER5蛋白表达水平及细胞凋亡情况进行检测。2应用生物信息学分析方法对IER5基因上游8000bp的序列进行启动子生物信息学分析,初步确定IER5基因启动子的可能位置。在此基础上,对IER5基因上游2000bp的序列构建一系列缺失体,重组报告基因质粒载体,转染离体培养的HepG2细胞,通过双荧光素酶报告基因检测方法检测辐射前后不同缺失体片段所对应的活性,确定与辐射诱导IER5基因表达有关的启动子区域。结果:1辐射对在体HepG2细胞IER5基因mRNA表达的影响:采用Real-time PCR方法检测mRNA水平。结果显示:辐射后4h在体HepG2细胞IER5基因mRNA表达增加,4Gy辐射比2Gy辐射更能够显著的上调IER5基因mRNA的表达,2Gy和4Gy辐射组与对照组(0Gy组)相比mRNA分别升高了1.344倍与11.542倍;但是在辐射后12hIER5基因mRNA表达明显下降,2Gy和4Gy辐射组IER5基因mRNA水平均低于对照组,且4Gy辐射组比2Gy辐射组IER5基因mRNA的水平更低,分别为对照组的0.327倍与0.349倍。2辐射对在体HepG2细胞IER5蛋白表达的影响:采用Western blot方法检测蛋白表达水平。结果显示:随着辐射剂量的增加IER5蛋白表达明显增加,4Gy辐射组HepG2细胞IER5蛋白表达水平明显高于2Gy辐射组。3辐射对在体HepG2细胞凋亡的影响:采用TUNEL染色法检测细胞凋亡。结果显示:随着辐射剂量的增加,在体HepG2细胞凋亡明显增加(P<0.01)。此与IER5基因mRNA及蛋白的表达具有相似的变化趋势,提示我们辐射可能通过上调IER5基因mRNA和蛋白的表达来增加肝癌细胞的凋亡。我们今后尚需对此进行更深入的研究。4辐射诱导HepG2细胞IER5基因表达的启动子区域:采用双荧光素酶报告基因技术分析和鉴定启动子活性。结果表明:IER5基因的启动子区域在-408bp ~ -238bp范围内;在该范围内可能存在的调控元件有四个,分别为:TGGCGC、GGCCGT、GCGCACA、CGCGG。经过对实验数据进行统计学分析,采用2Gy剂量辐射各个缺失体,辐射后IER5-3活性增高,辐射组与对照组之间有显著性差异(P=0.01),说明辐射能够上调IER5基因启动子的转录活性。结论:辐射可上调在体肝癌HepG2细胞IER5基因mRNA及蛋白的表达,4Gy辐射比2Gy辐射能够更显著的上调IER5基因mRNA及蛋白的表达,并且随着辐射剂量的增加,肿瘤细胞的凋亡明显增加,提示辐射可能通过上调IER5基因的表达来增加肝癌细胞的凋亡,预示着IER5基因可能为辐射敏感基因,增加该基因的表达可能会增加肝癌对放疗的敏感性,为进一步研究IER5基因的生物学功能奠定了基础。辐射诱导IER5基因表达的启动子区域位于-408bp~ -238bp范围内,可能存在的TGGCGC、GGCCGT、GCGCACA、CGCGG四个调控元件,为进一步研究IER5基因辐射诱导表达的调控机制奠定了基础。本研究扩展了人们对IER5基因生物学功能及调控机制的认识,值得我们今后对该基因做更深入的研究。总之,该论文对IER5基因的辐射效应及调控机制进行了有益的探索,主要创新点在于对在体肝癌HepG2细胞IER5基因的辐射效应进行了研究,更重要的是用实验方法确定了IER5基因的启动子区域,并找到了四个可能的调控元件,为进一步研究IER5基因的表达调控机制奠定了基础。