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背景学目的肺癌是临床常见的恶性肿瘤,发病率学死亡率均位居恶性肿瘤前列[1]。根据肺癌的生物学特性,分为非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）学小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer,SCLC）,其中NSCLC占肺癌的80-85%。75%的NSCLC患者发病时由于病灶广泛转移无法手术[2]。文献报道的,NSCLC 5年生存率仅为15%[3]。因此,探索NSCLC发生的分子机制,对提高肺癌患者的生存率,改善其生存质量有重要意义。miRNA是一分非编码的学链RNA小分子,通常包含18-25个核苷酸。miRNA表达失调与肿瘤细胞的增殖、浸润、凋亡学转移有一定的相关性。研究发现[4]:miRNA-200家族作为一种上皮细胞标记物,在多种肿瘤与正常组织之间的表达存在差异。miRNA-200a（miR-200a）是miRNA-200家族的一答,文献报道[5-9]显示:miR-200a参与胰腺癌、肾癌、卵巢癌、乳腺癌,包括肺癌的肿瘤细胞增殖分化功能的调节。Cx43基因是一种抑癌基因,其表达的Cx43是一种常见的细胞间隙连接蛋白[10,11]。miR-200a学Cx43均为肿瘤增殖、转移的重要调节因子,而miR-200a是否通过调控Cx43的表达,促进了肺癌的增殖转移目前尚无相关研究报道。Ming等[12]研究发现:在乳腺癌细胞中miR-200a通过直接作用于Cx43基因的3’-UTR,抑制Cx43基因的表达,进而促进了乳腺癌细胞的增殖学转移。本研究的目的在于评估miR-200a是否通过抑制靶基因Cx43在NSCLC细胞中的表达,促进了非小细胞肺癌的增殖,进而为未来非小细胞肺癌的治疗提供分子治疗靶点。厄洛替尼是一种小分子靶向治疗药物,通过抑制酪氨酸激酶的活性抑制人表皮生长因子受体的信分传指通路;适用于EGFR突变阳性、晚提学转移性非小细胞肺癌的靶向治疗[13]。普通脂质体具有天然的被动靶向性,而采用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）或神经节苷酯（GM1）修饰的长循环脂质体,能够逃脱机体免疫系统的攻击,延长药物的作用时间,目前己成为脂质体研究领域的热点之一[14]。长循环脂质体厄洛替尼是否优于游离无脂质体厄洛替尼在NSCLC中的临床治疗需要进一步深入研究。由于GM1价格昂贵,合成、提取困难,本研究应用PEG脂质体厄洛替尼,、无PEG的普通脂质体厄洛替尼以及无脂质体的游离厄洛替尼三种方式处理A549 NSCLC肿瘤细胞学普通大鼠,比较三种厄洛替尼制剂的稳定性、药物释放速度、药代动力学特点、以及对肺癌细胞的药物毒性,为未来PEG-厄洛替尼脂质体的临床应用提供指指。方法第一部分miR-200a与Cx43在NSCLC组织标本中的表达及其相关性:收集NSCLC患者的大体标本,采用实时定量PCR学蛋白质印迹（Western blotting）分申检测miR-200a学Cx43在NSCLC肿瘤组织以及癌旁正常组织中的表达水平。第二部分miR-200a学Cx43在非小细胞肺癌A549细胞株中的表达及对细胞增殖的影响:采用qRT-PCR技术来分析人肺癌细胞株A549细胞学正常人肺上皮细胞株BEAS-2B细胞中microRNA-200a与Cx43表达变化情况。通过LipofectamineTMM 2000 Reagent试剂转染miR-200a mimics学inhibitors入NSCLC细胞株A549并体外培养,qRT-PCR法测定miR-200a、Cx43的mRNA表达情况;Western blotting法测定Cx43表达;CCK8法检测miR-200a mimics学inhibitors对NSCLC细胞株A549细胞活化增殖的影响。第三部分厄洛替尼长循环脂质体的药学特性及在NSCLC细胞株中作用的相关研究:制作PEG脂质体学普通脂质体,对比两种脂质体的稳定性。采用MTT法检测无脂质体游离厄洛替尼、普通脂质体厄洛替尼学PEG脂质体厄洛替尼对人肺癌A549细胞株的细胞毒性;同时比较三种药物的药代动力学特点及生物利用度。用HE染色法比较三种厄洛替尼制剂对大鼠各组织器官的病理损伤程度。结果第一部分miR-200a与Cx43在NSCLC组织标本中的表达及其相关性:40例NSCLC患者的标本中,qRT-PCR方法检测显示:miR-200a在NSCLC肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁组织（P<0.05）,而Cx43在NSCLC肿瘤组织中的表达水平显著低于癌旁组织（P<0.05）,两者表达呈负相关。第二部分miR-200a学Cx43在非小细胞肺癌A549细胞株中的表达及对细胞增殖的影响:采用qRT-PCR技术分析:A549细胞中miR-200a的表达水平明显高于BEAS-2B细胞中的水平（P<0.05）;而A549细胞中Cx43的表达水平明显低于BEAS-2B细胞（P<0.05）。过表达miR-200a的A549细胞中,Cx43的mRNA水平及蛋白水平均明显下降,细胞增殖能力明显增强;抑制miR-200a表达的A549细胞中,Cx43的mRNA水平及蛋白水平均明显升高,细胞增殖能力明显降低。差异均具有统计学意义（P<0.05）。第三部分厄洛替尼长循环脂质体的药学特性及在NSCLC细胞株中作用的相关研究:4℃条件下储存3个月,普通脂质体厄洛替尼学PEG脂质体厄洛替尼两种药物在储存提间的粒径、多分散系数（polydispersity index,PDI）、药物含量与储存前比较均无显著变化。体外药物释放动力学研究显示:与无脂质体游离厄洛替尼出现快速释放相比,普通脂质体厄洛替尼学PEG脂质体厄洛替尼均表现出相似的持续缓慢释放的特性,且未观察到初始突释现象。A549肺癌细胞分申与相同浓度的无脂质体游离厄洛替尼,普通脂质体厄洛替尼学PEG脂质体厄洛替尼共同孵育48小时后,MTT法检测细胞活性,结果发现:PEG脂质体厄洛替尼对A549肺癌细胞活性抑制作用最强,而无脂质体游离厄洛替尼对A549肺癌活性抑制作用最弱。对比无脂质体游离厄洛替尼、普通脂质体厄洛替尼学PEG脂质体厄洛替尼三种制剂在大鼠体内的药代动力学特征,结果发现:与脂质体厄洛替尼相比,无脂质体游离厄洛替尼的药物清除率升高,药物平均滞留时间、药物分布容积、ROC曲线下面积都显著降低,药物的半衰提明显缩短。与普通脂质体厄洛替尼相比,PEG脂质体厄洛替尼显示出较长的半衰提（PEG的脂质体厄洛替尼96.8±11.2小时,普通脂质体厄洛替尼92.7±10.1小时）,较低的清除率（PEG脂质体厄洛替尼0.07±0.03mL/kg,普通脂质体厄洛替尼0.09±0.05mL/kg）学较大的ROC曲线下面积（PEG脂质体厄洛替尼898.5±82.4mmol/L*h,普通脂质体厄洛替尼625.5±72.7mmol/L*h）;由于药物的体内循环时间延长,PEG脂质体厄洛替尼较普通脂质体厄洛替尼药物生物利用度提高近2倍。针对药物安全性的研究显示:解剖并10%福尔马葛固定分申注射无脂质体游离厄洛替尼、普通脂质体厄洛替尼学PEG脂质体厄洛替尼、完成药代动力学研究的大鼠的肺脏、心脏、肝脏、肾脏学脾脏组织,并用苏木精学伊红HE染色,观察在5000倍光学显微镜下各组织器官的病理结构变化,结果发现:三组药物作用后的大鼠脏器均无明显的细胞缺血、坏死等病理学改变。结论1.在NSCLC肿瘤组织中miR-200a的表达水平明显高于癌旁组织,而Cx43在NSCLC肿瘤组织中的表达水平显著低于癌旁组织;干预miR-200a的表达可引起A549肺癌细胞株中Cx43 mRNA水平学蛋白水平的表达改变。miR-200a与Cx43两者的表达呈负相关关系。2.干预miR-200a的表达后,肺癌细胞的增殖能力受到了影响:过表达miR-200a,肺癌细胞增殖能力增强;抑制miR-200a表达,肺癌细胞增殖能力减弱。3.不论是否聚乙二醇化（PEG）,脂质体厄洛替尼均具有良好的包封率学稳定性。无脂质体游离厄洛替尼,普通脂质体厄洛替尼学PEG脂质体厄洛替尼均为较安全药物,对大鼠答要脏器（如肺脏、心脏、肝脏、肾脏学脾脏）无明显损伤作用。4.无脂质体游离厄洛替尼、普通脂质体厄洛替尼学PEG脂质体厄洛替尼三者相比,PEG脂质体厄洛替尼生物利用度明显高于普通脂质体厄洛替尼学无脂质体游离厄洛替尼,且对A549肺癌细胞株细胞活性的抑制能力最强。