研究背景及目的血管钙化是磷酸钙结晶异位沉积于心血管组织的结果。它降低了血管弹性,导致心血管血流动力学损害,与高血压、冠心病、主动脉瓣狭窄、心肌肥厚和其他心血管疾病的发病率和死亡率升高有关。过去的研究认为血管钙化是一个被动的和退化的过程,然而最近的研究表明,这个过程是通过一种类似于骨形成的主动调节来完成的。人们逐渐发现一些骨钙化调节因子定位于血管,而且这些骨钙化调节因子在健康血管和病变血管存在表达的差异,提示血管钙化的过程,与骨骼的成骨变化十分相似,并且这个过程的主导者为血管平滑肌细胞。血管平滑肌细胞是动脉中膜的主要细胞,在调节血管张力的过程中发挥着重要作用,但它并不是终末分化细胞,当周围环境信号发生变化,血管平滑肌细胞可以由分化状态的收缩表型转变为去分化状态的合成表型。这种表型的调整是增生型心血管疾病的重要发病机理。收缩表型的血管平滑肌细胞在维持动脉壁的结构和功能的完整性中发挥着重要作用。合成表型的血管平滑肌细胞会加速其迁移而最终导致血管钙化的形成。目前认为存在四种情况的血管钙化组织类型：①血管内膜钙化：与动脉粥样斑块形成有关,是斑块早期形成和斑块破裂风险增高的危险因素之一；②动脉中膜钙化：是2型糖尿病和终末期肾脏病患者血管损害的重要病理表现,导致血管顺应性下降,血管内膜钙化和中膜钙化有时同时存在,一方面增加了斑块破裂的风险,另一方面导致动脉僵硬,继而血流动力学损害。；③心脏瓣膜钙化：有研究表明心脏瓣膜钙化与血管钙化相似,是一种主动进展的过程,与成骨细胞样分化、炎症反应、间质细胞功能损害、细胞外基质重构等因素有关,最终导致钙化结节的产生；④钙化防御(calciphylaxis),又称为钙性尿毒症性小动脉病(calcific uremic arteriolopathy, CUA),是以系统性小动脉钙化和组织缺血为特征的一种少见、但致命的血管性疾病,主要表现为动脉血管钙化和皮肤溃疡、周围组织缺血性坏死,严重者出现坏疽。血管平滑肌细胞释放的基质小泡具有聚集和浓缩钙盐和磷酸盐的能力,因此而成为钙化过程的核心场所,血管平滑肌细胞还承担着表型转变的功能,在这个过程中存在一些与分化的软骨细胞和成骨细胞相关的转录因子的表达。这些转录因子的表达进一步诱导了多种矿化过程的调节蛋白的合成,如碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙素等。当血管平滑肌细胞表型转换时,原本具有收缩表型特征的细胞,包括血管平滑肌细胞、外膜细胞、钙化的血管细胞,能明显地分化为具有分泌功能的成骨样细胞。这些细胞原本存在一些平滑肌细胞的特征性标志物,如平滑肌胚胎型肌球蛋白重链、α-平滑肌肌动蛋白、心肌蛋白等,在转换的过程中,这些特异性标记物的表达减低,反之成骨活动相关的蛋白,如碱性磷酸酶、骨钙素、核心结合因子α-1(Cbfα1/Runx2)则表达增多。有关血管平滑肌细胞表型转换的机制到目前为止仍未完全阐明。runt相关转录因子-2(runt-related transcription factor-2, Runx2),又称核结合因子α-1(core-binding factor α-1, Cbfα1),是钙化过程中诱导成骨细胞和软骨细胞分化的一个关键转录因子。上调Runx2的表达能够促进成骨细胞早期分化,并抑制成骨细胞的成熟,表现为早期的、不成熟的成骨细胞数量增加。另一方面,对小鼠进行Runx2基因敲除,由于间充质细胞、骨原细胞等不能成功分化为成骨细胞,小鼠无法进行膜内和软骨内骨化成骨,可见Runx2是成骨细胞样分化所必需的因子。在平滑肌细胞中,Runx2在一般情况下不表达,但在炎症,氧化应激,骨形态发生蛋白-2(BMP-2)等致钙化刺激因素作用下表达上调,驱动血管平滑肌细胞转化为成骨细胞样细胞。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是转化生长因子(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族的一员,可诱导间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织。Smads家族是骨形态发生蛋白的胞内信号转导蛋白,根据其功能可分为3个亚组,即受体调节型Smads(R-smads),共同中介型Smads(Co-Smads)和抑制型Smads(I-Smads),Srmd1、Smad2、Smad3、Smad5、 Smad8、Smad9属于受体调节型亚组,Smad4属于共同中介型亚组,Smad6、Smad7系抑制型亚组成员。BMP激活Smdl/5/8后R-Smads与Co-Smads形成复合体,从而诱导Runx2基因表达。由Smads将细胞外的信号转导进入细胞核内,这一过程受到细胞膜、细胞内和细胞外多水平的正、负反馈调节。小分子核糖核酸(MicroRNAs, miRNAs)是一类由18-25个核苷酸构成的单链非编码RNA,它通过mRNA的3’-端非翻译区(untranslated regions, UTRs)与一个或者多个靶基因相结合,导致靶基因的翻译受到抑制,或者促进靶基因mRNA的降解,最终使靶基因表达沉默。MiRNAs在生物发育、新陈代谢、细胞增殖与分化、细胞凋亡等多个方面发挥着重要作用。miRNA的异常表达使得它们的靶基因功能失调,目前认为在肿瘤、自身免疫性疾病、糖尿病、神经障碍、心力衰竭、肺动脉高压等众多人类疾病的发生发展过程中扮演着重要角色。miRNA在心血管系统中高表达已经开始逐渐受到重视,新近研究显示,它不仅参与心血管系统增生性病变,而且参与了动脉粥样硬化和肺动脉高压发生发展过程。某些]miRNAs,例如miR-125b,miR-204,miR-29a/B,mir-30b/C等已被证实参与血管平滑肌细胞钙化的过程。然而,潜在的miRNA和其在血管平滑肌细胞分化导致血管钙化的作用机制仍有待于进一步研究。研究表明,miR-205可通过磷酸化Akt,靶定JPH4基因等,抑制癌细胞凋亡,从而在肿瘤发生、发展中起重要作用,头颈癌、卵巢癌及乳腺癌组织中可见到miR-205的高表达,其与浸润性磷状细胞癌关系密切。新近报道显示miR-205能通过靶向调控Runx2来调节成骨细胞的分化和骨形成。那么miR-205是否有可能通过调节Runx2参与血管平滑肌细胞的成骨细胞样分化,从而调控血管钙化的过程呢?我们的研究以人主动脉平滑肌细胞做为对象,构建平滑肌细胞钙化和成骨细胞样分化的模型,采用实时定量逆转录PCR、质粒构建和转染、小干扰RNA、荧光素酶检测等手段,观察miR-205在血管平滑肌细胞向成骨细胞样分化的过程中的表达和变化,调节miR-205及其靶基因的表达以探讨调控血管平滑肌细胞钙化的作用途径,进一步揭示血管钙化的发生机制。材料与方法1细胞培养和钙化模型的建立人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)进行传代和冻存,取第4-7代细胞培养于DMEM培养基,钙化组于培养基中添加10mMβ-磷酸甘油诱导钙化。2ALP活性和骨钙素分泌的测量收集细胞,测定裂解液中碱性磷酸酶活性。收集上清液,采用特异性放射免疫测定试剂盒测定骨钙素的分泌。结果用细胞总蛋白含量进行标准化。3茜素红染色细胞用70%乙醇室温下固定1小时,茜素红染色10分钟,镜下可观察到钙盐沉积处红染。氯化十六烷基吡啶孵育15分钟后茜素红染料由胞浆中释放出来,分光光度法测定在540nm进行测量,对钙盐沉积进行定量测试。结果用细胞总蛋白含量进行标准化。4实时定量逆转录PCR (qRT-PCR)收集各组细胞,提取RNA,进行逆转录和实时定量PCR,检测各组细胞中miR-205的表达和Runx2、Smadl的mRNA的表达水平。miRNA和mRNA相对表达量用U6或p肌动蛋白进行标准化,采用2-AACT方法进行评估。5Western印迹法收集各组细胞,提取蛋白,分别检测Runx2、Smad1蛋白的表达水平。ImageJ软件进行灰度值分析。6载体构建构建Smadl和Runx2-pcDNA3.1(+)真核表达载体。野生型Runx2或Smad13’-UTR (WT)克隆到pGL3-Basic载体。应用the QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit试剂盒对3’-UTR的种子序列诱发定点突变(Mut)。7细胞转染根据不同试验目的,用miR-205mimics, anti-miR-205, Runx2siRNA, Smad1siRNA及相应的阴性对照,以及上述质粒对细胞进行转染,转染48小时后下一步处理。8荧光素酶检测通过脂质体2000在24孔板中对细胞用荧光素酶报告质粒、miR-205mimics进行共转染。48小时后收集细胞,用双荧光素酶报告基因检测系统进行测量荧光素活性。计算相对荧光强度,并与空载对照比较。实验一式三份独立完成。9数据分析各组数据采用均数士标准差(Mean±SD)表示,Western blot的结果以对照组设定为“1”后计算实验组目标蛋白灰度值。各实验至少独立重复3次。运用SPSS16.0软件进行统计分析。统计分析采用t检验进行。P>0.05认为差异无统计学意义,P小于0.05认为差异有统计学意义。结果1在HASMCs的DMEM培养基中添加p-磷酸甘油进行干预后,茜素红染色呈阳性,碱性磷酸酶活性、骨钙素的分泌均增加,Runx2表达增加,显示p-磷酸甘油成功诱导人主动脉平滑肌细胞钙化和向成骨细胞样分化。2为了探讨miR-205与HASMCs钙化过程是否存在关联,我们用实时定量逆转录PCR技术检测miR-205的表达,结果显示,随着β-磷酸甘油干预时间的延长,miR-205的水平逐渐下降,提示miR-205在HASMCs钙化的过程中表达下调。3为了进一步了解miR-205在细胞分化中的作用,利用化学修饰的方法调节miR-205的表达。分别以miR-205mimics,anti-miR-205,以及相应的对照物对细胞进行转染,qRT-PCR技术检测miR-205的表达。结果显示,通过上述转染可使miR-205水平上调或者下调,其作用能维持到第8天,第8天之后miR-205mimics转染组和anti-miR-205转染组miR-205的表达与对照组无差异。4通过调节miR-205的表达探讨其对HASMCs钙化的调控作用。anti-miR-205转染组与对照组相比,钙盐沉积增加,Runx2蛋白表达增多,ALP活性加强,骨钙素水平升高,提示miR-205的沉默能显著增强HASMCs钙化和成骨样分化的过程。而miR-205-minics转染组与对照组相比,钙盐沉积减少,Runx2蛋白表达减少,ALP活性和骨钙素水平均降低。可见,miR-205在β-磷酸甘油诱导HASMCs钙化的过程中起到负性调节的作用。5从miR-205的靶基因中筛选可能与血管钙化有关的基因。有报道指出Runx2或Smad1是miR-205的靶基因,而这两者均为骨发生的重要介质,我们将进一步探讨确定他们是否参与了平滑肌细胞向成骨细胞样分化的调控。找出Runx2和SmadlmRNA位于3’-UTRs段可能的靶位点。Runx2和Smad1的3’-UTRs区域包含有野生型或突变型靶位点的荧光素酶报告基因质粒与miR-205-mimics共同转染细胞,48小时后检测荧光素酶活性。结果显示,与对照组相比,miR-205-mimics转染组过表达miR-205,减少了Runx2和Smad1野生型3’-UTRs的荧光素酶活性,对突变性3’-UTRs的荧光素酶活性则无影响。这显示出miR-205通过与Runx2和Smad13’-UTRs的靶位点相结合,直接抑制了Runx2与Smad1的表达。进一步的实时定量PCR检测表明,过表达miR-205对Runx2和Smad1的mRNA水平没有影响。然而,miR-205-mimics转染组Runx2和Smad1蛋白的表达水平下降,证实miR-205是从转录后的翻译水平调控Runx2和Smad1的表达。6通过调节靶基因的表达探讨miR-205调节血管钙化途径。我们通过Runx2和Smad1过表达质粒来恢复miR-205导致HASMCs的Runx2和Smad水平减少,然后观察ALP和骨钙素的水平。结果显示过表达Runx2或Smad1能增加ALP活性和骨钙素的分泌,显示过表达Runx2或Smad1消除了miR-205在HASMCs钙化过程中的负性调节作用。我们又进一步将Runx2siRNA或Smad1siRNA与anti-miR-205共同对HASMCs进行转染,几乎可以完全消除anti-miR-205对这些指标的上调的作用。综合这些结果表明,Runx2和Smad1是miR-205的功能性靶点,miR-205通过调节Runx2和Smad1蛋白的表达来发挥调控血管钙化的作用。。结论1通过碱性磷酸酶、骨钙素、Runx2、钙盐沉积四项指标证实,β-磷酸甘油可成功诱导人主动脉平滑肌细胞钙化及向成骨细胞样分化。2在人主动脉平滑肌细胞向成骨细胞样分化的过程中内源性miR-205表达减少,进一步研究显示miR-205对分化过程起负性调节的作用。3miR-205调控人主动脉平滑肌细胞钙化的过程与Runx2和Smad1有关。4miR-205通过与Runx2和Smad13’-UTRs的靶位点相结合,直接抑制了Runx2与Smad1的表达,从而抑制人主动脉平滑肌细胞向成骨细胞的转化。