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为研究Bcl-2和Inhibinα基因对颗粒细胞增殖凋亡的作用,构建了Bcl-2基因干扰载体(psiRNA b1、psiRNA b2、psiRNA b3)和Inhibinα基因干扰载体(psiRNA-INHα1和psiRNA-INHα2),利用鹅F1和闭锁卵泡颗粒细胞模型研究干扰这两个基因后的表型。分别用荧光显微镜和流式细胞仪测定转染RNA干扰质粒48h后的转染效率、Bcl-2和Inhibinα基因表达水平、细胞生长周期、细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)和增殖指数(proliferation index,PI)的变化;用放免法测定细胞培养上清中雌二醇和孕酮水平。试验结果如下:1.利用Ambion的RNA干扰设计软件,根据Genbank中已发表的序列(D11381)针对Bcl-2基因设计三对干扰序列,并根据RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体的特点在设计的序列上做了分别命名为psiRNA b1、psiRNA b2、psiRNA b3。针对Inhibinα亚基(NM-001031257)设计两对干扰序列,分别命名为psiRNA-INHα1和psiRNA-INHα2。2.采用无血清培养方法体外培养鹅卵泡颗粒细胞,将我们构建的Bcl-2和Inhibinα基因干扰载体脂质体包裹转染颗粒细胞,48h后荧光显微镜检测转染效率,干扰组转染效率达到60%以上。3.流式细胞仪检测颗粒细胞中Bcl-2蛋白表达,3个干扰组中当Bcl-2基因被干扰后颗粒细胞分泌Bcl-2蛋白明显降低,且差异显著,尤其是psiRNAb3组蛋白表达最低。4.当颗粒细胞Bcl-2表达下调时,颗粒细胞增殖指数明显上升,且随Bcl-2表达量减少而上升,增加的程度与Bcl-2表达量显著负相关(r=-0.872,p<0.05),颗粒细胞凋亡指数也明显上升,增加的程度与Bcl-2表达减少显著相关(r=-0.951,p<0.05)。放免法检测Bcl-2基因干扰后颗粒细胞P分泌水平显著上升,E2分泌受到抑制。5.闭锁卵泡颗粒细胞凋亡比例显著高于F1卵泡颗粒细胞,Inhibinα基因干扰后F1和闭锁卵泡颗粒细胞抑制素表达水平比对照组降低(P<0.05)。6.当颗粒细胞Inhibinα基因表达下调时,细胞凋亡指数和增殖指数显著高于对照组(p<0.05),细胞分泌雌激素水平显著下降(p<0.05),而细胞P分泌显著上升(p<0.05)。结果表明,(1)Inhibinα基因干扰后卵泡颗粒细胞抑制素表达水平比对照组显著降低30~40%(p<0.05);细胞凋亡指数和增殖指数显著增高(p<0.05);细胞分泌雌激素水平显著下降(p<0.05)。(2)Bcl-2基因干扰后颗粒细胞Bcl-2蛋白表达水平显著低于所有对照组(p<0.05),细胞凋亡指数、增殖指数和孕激素(P)分泌水平均高于对照组。由此推断,Bcl-2和Inhibinα基因对颗粒细胞具有显著的抗凋亡效应。