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目的(1)检测不同病理类型肺癌细胞株中hTERT mRNA表达情况,探讨hTERT mRNA随着原代细胞传代的变化并筛选出表达量较高的肺癌细胞系进行后期实验。(2)设计并化学合成3对靶向hTERT mRNA的siRNA序列并转染入95D细胞中,探讨hTERT mRNA-siRNA对hTERT基因的沉默和肺癌细胞的增值抑制作用,并筛选出具有高效干扰效果的siRNA序列。(3)将hTERT mRNA-siRNA重组入质粒介载体中,并稳定转染到肺癌H1299细胞,探讨在肺巨细胞癌95D细胞株中筛选出的siRNA序列在肺腺癌H1299细胞是否具有干扰效应,siRNA干扰作用是否在不同癌症的病理类型存在差异。方法(1)培养多种不同类型的肺癌细胞株及从肺癌病人组织中获取的原代细胞株,用TRIZOL法提取细胞总RNA。然后运用Real Time RT-PCR法检测各细胞株中hTERT mRNA的表达,并对荧光定量PCR后的扩增产物做琼脂糖凝胶电泳。(2)设计3对hTERT mRNA-siRNA分别转染95D细胞,分别运用Real Time RT-PCR技术、western blot技术、MTT、流式细胞仪等方法比较转染前后及转染不同siRNA序列细胞中hTERT mRNA表达、hTERT蛋白表达、细胞周期间差异。筛选出高效的siRNA序列。(3)构建siRNA表达载体,通过脂质体的方法将重组siRNA表达载体及空白载体转染到肺癌H1299细胞,G418筛选、单克隆之后获得稳定转染细胞。分别运用Real Time RT-PCR技术、western blot技术、MTT、流式细胞仪等方法比较重组siRNA表达载体及空白载体组细胞中hTERT mRNA表达、hTERT蛋白表达、细胞周期间差异。进一步验证筛选出的siRNA的高效性。结果(1)在肺癌细胞中,hTERT mRNA均有表达,其中肺巨细胞癌细胞95D表达最高；而对于肺癌原代细胞,随着传代次数的增加,hTERT mRNA表达逐渐下降。(2)hTERT siRNA转染95D细胞48小时后(转染浓度为100nmol/L),与空白脂质体对照组和阴性对照组比较,siRNA-1和siRNA-2均明显抑制了hTERT mRNA表达(P值均小于0.01),抑制率分别为77.33±5.13%和50.67±8.02%,siRNA-3抑制率较低,仅为27.67±10.26%。(3)选取抑制效果最显著的hTERT siRNA-1对95D肺癌细胞进行由低到高3个浓度的转染,转染浓度分别为50nmol/L,80nmol/L,100nmol/L。50nmol/L浓度转染组与阴性对照组之间hTERT mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05)。80nmol/L组、100nmol/L浓度转染组分别与阴性对照组比较,hTERT mRNA表达量差异均有统计学意义(P值均小于0.01),而这两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。(4)转染48h后,与空白脂质体对照组比较,50nmol/L、80mol/L、100nmol/L浓度的hTERT siRNA-1转染组细胞凋亡率均显著增加(P值均小于0.01)。与阴性对照组比较,50nmol/L浓度转染组的细胞凋亡率无显著增加(P>0.05),而80nmol/L、100nmol/L组细胞凋亡率显著增加(P值均小于0.01)。空白脂质体对照组与阴性对照组比较亦有显著差异(P<0.05)。(5)MTT检测结果显示,转染12小时后肺癌细胞增殖抑制作用开始显现,但效果尚弱,24小时已较明显,48小时最显著,72小时抑制效果转弱。hTERT siRNA可以有效抑制肺癌细胞增殖,抑制效应具有时间依赖性。(6) pGenesil.1-hTERT转染H1299细胞经单克隆后获得稳定转染细胞株H1299-pGenesil.1-hTERT和H1299-pGenesil.1。与稳定转染空白质粒细胞组相比,稳定转染siRNA质粒细胞的hTERT mRNA表达量显著下降,抑制率为93.97±0.83%,P<0.01。(7)肺癌H1299-pGenesil.1-hTERT细胞较H1299-pGenesil.1细胞hTERT蛋白的表达受到明显抑制。(8)肺癌H1299-pGenesil.1-hTERT细胞较H1299--pGenesil.1细胞增殖能力降低。(9)H1299-pGenesil.1-hTERT细胞与对照组H1299-pGenesil.1比较,G1期细胞增多,比对照组增加了18.3%(P<0.05),S、G2期细胞分别少了10.4%、7.9%(P<0.05)。结论(1)hTERT基因在不同类型肺癌细胞均有表达；随着原代肺癌细胞的传代培养传代增加,hTERT表达量逐渐下降。(2)人肺癌细胞系L78、NCI-H520、A549、LTEP-α-2、NCI-H460和95D中hTERT mRNA均高表达,其中肺巨细胞癌细胞95D相对表达量最高。(3)有效设计并合成了特异性针对hTERT的siRNA,可以有效下调肺巨细胞癌细胞95D的端粒酶hTERT mRNA表达,从而抑制端粒酶活性、诱导肺癌细胞凋亡,抑制肺癌细胞增殖。(3)成功构建的hTERT mRNA-siRNA表达质粒转染进肺癌H1299细胞后,可以有效下调细胞中hTERT mRNA、蛋白表达,抑制端粒酶活性和肺癌细胞的增殖,改变细胞周期。