干扰素(Interferon，IFN)是一类动物机体产生的多功能分泌蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等生物学功能。α干扰素(Interferon alpha，IFN-α)主要由单核一吞噬细胞产生，是天然免疫和获得性免疫的桥梁，可以激活NK细胞的细胞毒性并促进其增殖，调节机体免疫。γ干扰素(interferon gamma，IFN—γ)是由激活的T细胞和NK细胞产生、具有抗病毒和免疫调节功能的细胞因子。 猪α和γ干扰素都具有抗病毒作用，既可以与疫苗配合使用，增强免疫效果，也可以单独使用，提高动物的免疫机能，治疗猪病毒性疾病。本研究旨在应用毕赤酵母表达系统来分泌表达有活性的重组猪α和γ干扰素，为实现猪α和γ干扰素工业化生产和进一步研究其生物学功能提供实验基础。 应用DNASTAR(Version5.0)基因分析软件，参照NCBI GenBank上登载的猪α干扰素基因成熟肽核苷酸序列(AY331298)和猪γ干扰素基因成熟肽核苷酸序列(EU249804)，以及毕赤酵母菌的密码子用法分析，依据毕赤酵母表达系统密码子的偏嗜性，选择高表达密码子重新设计合成新的猪α和γ干扰素成熟肽核苷酸序列。保持原猪α和γ干扰素基因序列氨基酸排列顺序不变，因此表达的蛋白质不发生变化，活性不变。另外，设计并合成了引物Pα1/Pα2和Pγ1/Pγ2，以及一对表达载体引物P3/P4。根据该基因的酶切图谱和表达载体多克隆位点的分析，在上游引物Pα1和Pγ1中加入了限制性内切酶EcoRⅠ，在下游引物Pa2和Pγ2中加入了限制性内切酶KpnⅠ，便于后续试验。 分别以重新设计合成的干扰素α和γ成熟肽核苷酸为模板，相对应的使用引物Pα1/Pα2和Pγ1/Pγ2进行PCR扩增，扩增出猪α和γ干扰素的成熟肽基因，扩增长度分别为518bp和449bp。将目的片断与连接载体pMD18-T连接，经转化大肠杆菌，得到阳性克隆pMD—IFN-α和pMD—IFN—γ。pMD—IFN-α和pMD—IFN—γ与表达载体pPICZαC经过EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切，然后连接转化大肠杆菌，得到重组表达质粒pPICZαC—IFN-α和pPICZαC—IFN—γ，送公司测序鉴定，结果显示重新设计合成的目的基因完整ORF已经正确插入表达载体pPICZαC中。 重组表达质粒pPICZαC—IFN-α和pPICZαC—IFN—γ经SacⅠ单酶切电泳后，纯化回收，电击转化感受态的毕赤酵母工程菌X—33，涂布YPDS+ZeocinTM选择性培养基，置28℃温箱培养4～5d，结果获得多个单菌落。通过提高抗生素浓度，筛选出具高抗性的转化子。进行诱导表达，每24h添加一次甲醇，保持终浓度为1.0％。诱导表达4d后，收集菌液，离心，取上清。pPICZαC—IFN-α诱导表达产物取少量上清液进行SDS-PAGE电泳分析，可见一条分子量约19Kda的清晰蛋白条带；而pPICZαC—IFN—γ诱导表达产物进行SDS-PAGE电泳分析，可见两条分子量分别为17Kda和23Kda的清晰蛋白条带，而空载体转化宿主菌的对照未发现特异的蛋白条带。将表达蛋白进行Western—blot分析，显示表达蛋白与小鼠抗猪α和γ干扰素单克隆抗体均能发生特异的抗原—抗体反应，具有免疫原性。表达产物经过薄层仪扫描，再经过labwork软件分析，所获得的猪α和γ干扰素的有效蛋白含量分别为54.105mg/L和79.976mg/L，分别占总蛋白的69.67％和79.63％。 试验采用非洲绿猴肾细胞(Vero)—水泡性口炎病毒(VSV)系统以细胞病变抑制法来测定重组猪α和γ干扰素的效价。以保护半数(50％)细胞免受病毒损害的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。本实验经过密码子改造所表达的猪α和γ干扰素效价分别达到5.87×107U/L和1.6×107U/L，而本实验室保存的未经过改造的猪α和γ干扰素经同样方法处理效价分别为1.817×106U/L和1.01×106U/L。 本研究成功地构建了重组酵母表达质粒pPICZαC—IFN-α和pPICZαC—IFN—γ，并在毕赤酵母中对猪α和γ干扰素实现了正确表达，表达的重组蛋白对VSV病毒在Vero细胞上的增殖有抑制作用。证明表达的该蛋白在预防和治疗猪病毒性疾病方面以及在调节机体免疫方面具有潜在的应用前景和推广价值。